Рослинні та патогенні матеріали
Популяцію для картування асоціацій сорго, відому як конверсійна популяція сорго (SCP), надав доктор Пет Браун з Університету Іллінойсу (зараз у Каліфорнійському університеті в Девісі). Вона була описана раніше і являє собою колекцію різноманітних ліній, перетворених на нечутливі до фотоперіоду та меншого зросту, щоб полегшити ріст і розвиток рослин в умовах США. У цьому дослідженні було використано 510 ліній з цієї популяції, хоча через погану схожість та інші проблеми з контролем якості не всі лінії були використані для аналізу всіх трьох ознак. Зрештою, дані 345 ліній були використані для аналізу хітинової відповіді, 472 ліній - для відповіді flg22 та 456 - для стійкості до TLS.Б. кукіШтам LSLP18 був отриманий від доктора Берта Блума з Університету Арканзасу.
Вимірювання відповіді MAMP
У цьому дослідженні було використано два різних MAMP flg22 (каталог Genscript № RP19986) та хітин. Рослини сорго вирощували у вставках, розміщених на плоских поверхнях, заповнених ґрунтом (33% суміші для вирощування Sunshine Redi-Earth Pro) у теплиці. Рослини поливали за день до збору зразків, щоб уникнути додаткового зволоження листя в день збору.
Лінії були рандомізовані та, з логістичних міркувань, висаджені партіями по 60 ліній. Для кожної лінії було висаджено три «горщики» з двома насінинами на лінію. Наступні партії висаджували одразу після обробки попередньої партії, доки не було оцінено всю популяцію. Було проведено два експериментальні прогони для обох MAMP з повторно рандомізованими генотипами в кожному з двох прогонів.
Аналізи ROS проводили, як описано раніше. Коротко кажучи, для кожної лінії шість насінин було висаджено в 3 різні горщики. З отриманих саджанців було відібрано три на основі однорідності. Саджанці, які виглядали незвично або були значно вищими чи нижчими за більшість, не використовувалися. Чотири листкові диски діаметром 3 мм були вирізані з найширшої частини 4-го листка трьох різних 15-денних рослин сорго. По одному диску на листок з двох рослин і два диски з однієї рослини, причому другий диск став контролем води (див. нижче). Диски окремо флотували на 50 мкл H2O у чорному 96-лунковому планшеті, герметизували алюмінієвою плівкою, щоб уникнути впливу світла, і витримували при кімнатній температурі протягом ночі. Наступного ранку реакційний розчин було приготовано з використанням 2 мг/мл хемілюмінесцентного зонда L-012 (Wako, каталожний № 120-04891), 2 мг/мл пероксидази хрону (тип VI-A, Sigma-Aldrich, каталожний № P6782) та 100 мг/мл хітину або 2 мкМ Flg22. 50 мкл цього реакційного розчину було додано до трьох з чотирьох лунок. Четверта лунка була контрольною, до якої було додано реакційний розчин без MAMP. У кожен планшет також було включено чотири холості лунки, що містили лише воду.
Після додавання реакційного розчину люмінесценцію вимірювали за допомогою багатодетекторного планшетного рідера Synergy™ 2 (BioTek) кожні 2 хвилини протягом 1 години. Планшетний рідер проводив вимірювання люмінесценції кожні 2 хвилини протягом цієї 1 години. Суму всіх 31 показників розраховували для отримання значення для кожної лунки. Розрахункове значення MAMP-відповіді для кожного генотипу розраховували як (середнє значення люмінесценції трьох експериментальних лунок - значення для контрольної лунки) - мінус середнє значення для холостої лунки. Значення для холостої лунки були стабільно близькими до нуля.
Листові дискиНікотіана бентаміана, одну високочутливу лінію сорго (SC0003) та одну низькочутливу лінію сорго (PI 6069) також було включено як контролі в кожен 96-лунковий планшет з метою контролю якості.
Б. кукіпідготовка інокуляту та інокуляція
Б. кукіІнокулят готували, як описано раніше. Коротко кажучи, зерна сорго замочували у воді протягом трьох днів, промивали, складали в конічні колби об'ємом 1 л та автоклавували протягом години при тиску 15 фунтів на квадратний дюйм та температурі 121 °C. Потім зерна інокулювали приблизно 5 мл мацерованого міцелію зі свіжої культури.Б. кукіІзоляти LSLP18 та залишали на 2 тижні при кімнатній температурі, струшуючи колби кожні 3 дні. Через 2 тижні заражені грибком зерна сорго висушували на повітрі, а потім зберігали при температурі 4 °C до польової інокуляції. Той самий інокулят використовували протягом усього випробування та готували свіжим щороку. Для інокуляції 6–10 заражених зерен поміщали в мутовку 4–5-тижневих рослин сорго. Спори, що утворювалися цими грибами, ініціювали інфекцію у молодих рослин сорго протягом тижня.
Підготовка насіння
Перед висадкою в поле насіння сорго обробляли сумішшю фунгіциду, інсектициду та антидоту, що містила ~ 1% фунгіциду Spirato 480 FS, 4% фунгіциду Sebring 480 FS, 3% антидоту Sorpro 940 ES. Потім насіння сушили на повітрі протягом 3 днів, що забезпечило тонке покриття цієї суміші навколо насіння. Антидот дозволив використовувати гербіцид Dual Magnum як досходову обробку.
Оцінка стійкості до цільової плямистості листя
SCP було висаджено на Центральній дослідницькій станції сільськогосподарських культур у Клейтоні, штат Північна Кароліна, 14–15 червня 2017 року та 20 червня 2018 року за рандомізованою повноблочною схемою з двома експериментальними повторностями в кожному випадку. Досліди були висаджені окремими рядами шириною 1,8 м з шириною міжряддя 0,9 м, використовуючи 10 насінин на ділянку. Два прикордонні ряди було висаджено по периферії кожного експерименту для запобігання крайовим ефектам. Досліди були інокульовані 20 липня 2017 року та 20 липня 2018 року, на той момент рослини сорго досягли 3 стадії росту. Оцінки проводилися за шкалою від одного до дев'яти, де рослини, що не мали ознак хвороби, оцінювалися як дев'ять, а повністю мертві рослини - як один. У 2017 році було проведено дві оцінки, а у 2018 році - чотири вимірювання, починаючи через два тижні після інокуляції щороку. sAUDPC (стандартизована площа під кривою прогресування хвороби) розраховували, як описано раніше.
Час публікації: 01 квітня 2021 р.