Пестициди відіграють вирішальну роль у вирішенні проблеми глобальної нестачі продовольства та боротьби з трансмісивними захворюваннями людини. Однак зростаюча проблема резистентності до пестицидів терміново вимагає відкриття нових сполук, спрямованих на недостатньо використовувані мішені. Канали потенціалу транзиторних рецепторів комах (TRPV) — Nanzhong (Nan) та неактивні (Iav) — можуть утворювати гетерологічні канали (Nan-Iav) та локалізуватися в механосенсорних органах, що опосередковують геотропізм, слух та пропріоцепцію у комах. Деякі пестициди, такі як афідопіролідон (AP), впливають на Nan-Iav за допомогою невідомих механізмів. AP ефективний проти колючо-сисних комах (hemiptera), запобігаючи харчуванню, порушуючи функцію філаментів. AP може зв'язуватися лише з Nan, але лише Nan-Iav може взаємодіяти з агоністами, включаючи ендогенний нікотинамід (NAM), тим самим проявляючи активність каналів. Незважаючи на потенціал Nan-Iav як мішені для інсектицидів, мало що відомо про його збірку каналів, регуляторні сайти зв'язування та Ca2+-залежну регуляцію, що перешкоджає подальшому розвитку інсектицидів. У цьому дослідженні кріоелектронну мікроскопію було використано для визначення структури Nan-Iav у комах родини Hemiptera у стані, вільному від ліганду кальмодуліну, а також з AP та NAM на межі цитоплазматичного домену анкіринових повторів (ARD). Несподівано ми виявили, що сам білок Nan може утворювати пентамер, який стабілізується за допомогою AP-опосередкованих ARD взаємодій. Це дослідження виявляє молекулярні взаємодії між інсектицидами та агоністами та Nan-Iav, підкреслюючи важливість ARD у функціонуванні та складанні каналів, а також досліджуючи механізм регуляції Ca2+.
На тлі дедалі серйозніших глобальних змін клімату погіршення глобальної продовольчої безпеки є одним з головних викликів 21-го століття з каскадними наслідками для суспільства.1,2У звіті Всесвітньої організації охорони здоров'я «Стан продовольчої безпеки та харчування у світі за 2023 рік» (SOFI) зазначається, що приблизно 2,33 мільярда людей у світі страждають від помірної та тяжкої продовольчої небезпеки, що є давньою проблемою.3,4На жаль, за оцінками, від 20% до 30% або більше врожайності сільськогосподарських культур щорічно втрачається через шкідників та патогени, і очікується, що глобальне потепління посилить стійкість до шкідників та вразливість сільськогосподарських культур.4, 5, 6, 7, 8Розробка пестицидів має вирішальне значення не лише для захисту сільськогосподарських культур від шкідників та зменшення поширення трансмісивних патогенів, але й для боротьби з трансмісивними захворюваннями людини, такими як лихоманка денге, малярія та хвороба Шагаса, які стають дедалі стійкішими до пестицидів.5, 9, 10, 11
Серед основних мішеней нейротоксичних інсектицидів гетеротетрамерний TRPV-канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) являє собою клас інсектицидних мішеней, відкритих лише в останнє десятиліття, включаючи комерційно доступні інсектициди, такі як імідаклоприд та піраклостробін.12, 13, 14Напівсинтетичний інсектицид афідопіроліфен (АП) – це нещодавно розроблений та комерціалізований продукт, основним компонентом якого є активний інсектицид Inscalis®, що зв'язує АП на субнаномолярному рівні активності.15АП демонструє низьку гостру токсичність для запилювачів, корисних комах та інших нецільових організмів, а при використанні відповідно до інструкцій на етикетці може знизити стійкість до інших інсектицидів.16, 17, 18Nan та Iav широко поширені серед видів комах, коекспресуються лише в нейронах рецепторів розтягування хорд антен та кінцівок і є критично важливими для слуху, сприйняття сили тяжіння та пропріоцепції.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, імідаклоприд та піраклостробін стимулюють комплекс Nan-Iav за допомогою унікального механізму, зрештою пригнічуючи пропріоцептивну передачу сигналу.13, 16, 23У колючо-сисних комах (полутвердих комах), таких як попелиці та білокрилки, втрата пропріоцепції погіршує їхню здатність до живлення, що зрештою призводить до смерті.13,24Цікаво, що AP демонструє високу спорідненість до комплексу Nan-Iav та низьку спорідненість лише до Nan. Зв'язування AP з Nan-Iav індукує електричний струм, але зв'язування лише з Nan не стимулює активність каналу. Сам Iav взагалі не зв'язується з AP.16Це свідчить про те, що Nan та Iav можуть зв'язуватися, утворюючи різні комплекси каналів Nan-Iav (наприклад, з різними стехіометричними співвідношеннями або різними розташуваннями в межах одного стехіометричного співвідношення), або що AP може зв'язуватися з кількома сайтами. Крім того, природний агоніст нікотинамід (NAM) зв'язується з Nan-Iav дрозофіли з мікромолярною спорідненістю, проявляючи ефекти, подібні до ефектів попелиць (AP) in vitro.16,25та пригнічення розмноження та живлення попелиці, що зрештою призводить до її загибелі25,26Ці дані викликають багато питань. Наприклад, залишається незрозумілим, як утворюється гетеродимер Nan-Iav, які сайти зв'язування використовуються для модуляції малих молекул, і як ці малі молекули регулюють функцію каналу, пригнічуючи пропріоцепцію. Крім того, залишаються незрозумілими причини, чому сам Nan неактивний і має низьку спорідненість до AP, тоді як гетеродимер Nan-Iav активний і зв'язується з AP з вищою спорідненістю. Зрештою, мало що відомо про Ca2+-залежну регуляцію функції Nan-Iav і про те, як вона інтегрована в процеси нейрональної сигналізації.13,21
У цьому дослідженні, поєднуючи кріоелектронну мікроскопію, електрофізіологію та методи зв'язування радіолігандів, ми з'ясували структуру Nan-Iav та механізм його зв'язування з регуляторами малих молекул. Крім того, ми виявили конститутивно зв'язаний кальмодулін (CaM) з Iav та AP-стабілізованими пентамерами Nan. Ці результати дають важливе розуміння регуляції іонів кальцію в каналах, структури каналів та факторів, що визначають спорідненість зв'язування лігандів. Що ще важливіше, ми підтвердили, що ARD відіграє центральну роль у цих процесах. Наше дослідження повних каналів комах, пов'язаних з відповідними сільськогосподарськими пестицидами.27, 28, 29відкриває перспективи для розвитку пестицидної промисловості, покращуючи ефективність та специфічність пестицидів, а також дозволяючи застосовувати сполуки, спрямовані на TRPV, до інших видів для вирішення питань глобальної продовольчої безпеки та поширення трансмісивних хвороб.
Ми також виявили, що Nan-Iav регулюється Ca2+, а механізм регуляції опосередковується конститутивно зв'язаним CaM. Важливо, що ця Ca2+-залежна регуляція Nav за допомогою CaM суттєво відрізняється від механізмів регуляції інших іонних каналів (наприклад, потенціал-залежних Na+ каналів та TRPV5/6 каналів).52, 53, 54, 55, 56, 57У каналі Nav1.2 C-кінцевий домен CaM спірально асоціюється з C-кінцевим доменом (CTD), а Ca2+ індукує зв'язування свого N-кінцевого домену з дистальною частиною CTD.56У каналі TRPV5/6 C-кінцевий домен CaM зв'язується з CTH, а Ca2+ індукує висхідне розширення свого N-кінцевого домену в пору, тим самим блокуючи проникність катіонів.53,54Ми пропонуємо модель Ca2+-регульованої функції Nan-Iav-CaM (рис. 4h). У цій моделі N-кінцевий домен CaM конститутивно зв'язується з C-кінцевим доменом (CTH) Iav. У стані спокою (низька концентрація [Ca2+]) C-кінцевий домен CaM взаємодіє з Nan, стабілізуючи конформацію ARD і тим самим сприяючи відкриттю каналу. Зв'язування агоніста/інсектициду з каналом індукує відкриття пор, що призводить до притоку Ca2+. Потім Ca2+ зв'язується з CaM, викликаючи дисоціацію C-кінцевого домену від ARD Nan. Оскільки блокування зв'язування CaM по суті скасовує інгібуючий ефект Ca2+, ця дисоціація модулює рухливість ARD, тим самим викликаючи Ca2+-залежне гальмування або десенсибілізацію. Швидке відновлення струмів каналу після елюції іонів кальцію (рис. 4g) свідчить про те, що цей механізм сприяє швидким реакціям на Ca2+-опосередковані нейрональні сигнали. Крім того, повідомлялося, що C-кінцева область Iav, яка залишається маловивченою, відіграє інші ролі в таргетуванні каналів та регуляції струму.21
Зрештою, наше дослідження представляє структуру високої роздільної здатності інсектицидно-інсектицидного TRP-каналу сільськогосподарського значення — відкриття, раніше невідоме нам. Примітно, що ми охарактеризували структуру та функцію каналу комахи в клітинах людини (HEK293S GnTi–), а не в клітинах комах. Враховуючи зростаючу стійкість до інсектицидів та постійний тиск на продовольчу безпеку та патогени, наша робота надає важливу інформацію, яка сприятиме розробці нових інсектицидів на благо здоров'я людини та глобальної продовольчої безпеки. Дослідження показали, що інсектициди, такі як AP, ефективні проти деяких шкідників при використанні відповідно до інструкцій на етикетці та мають низьку гостру токсичність для корисних запилювачів, що демонструє їхню екологічну безпеку.13,16Крім того, тестування деяких похідних AP на комарах показало, що вони з часом втрачають здатність літати. Розуміння того, як ці модулюючі сполуки зв'язуються з Nan-Iav, сприятиме модифікації існуючих сполук або розробці нових сполук для більш ефективного таточнийборотьба зі шкідниками. Наше дослідження демонструє, що інтерфейс Nan-Iav ARD є критично важливим не лише для регулювання активності ендогенних сполук, пестицидів та Ca2+-CaM, але й для складання каналів. Ми припускаємо, що порушення складання гетеродимерів за допомогою малих молекул може бути унікальним та перспективним підходом до розробки інгібіторів іонних каналів.
З восьми ортологічних генів були відібрані повнорозмірні гени бурого жука (Halyomorpha halys) Nanchung та Inactive, які демонструють чудову стабільність у детергентах. Синтезовані гени були оптимізовані за кодонами для експресії у людини та клоновані у вектор pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) з використанням сайтів рестрикції XhoI та EcoRI. Це гарантувало, що клони знаходяться в рамці з C-кінцевими мітками GFP-FLAG-10xHis та mCherry-FLAG-10xHis, які розщеплюються протеазою HRC-3C (PPX), що дозволяє незалежне...виразПраймери, що використовувалися для клонування Nanchung та Inactive у вектор pBacMam, були наступними:
Мікроскопічні зображення окремих частинок були отримані на просвічувальному електронному мікроскопі Titan Krios G2 (FEI), оснащеному камерою K3 та енергетичним фільтром Gatan BioQuantum. Мікроскоп працював при енергії 300 кеВ, з енергією 20 еВ, розміром пікселя зразка 1,08 Å/піксель (номінальне збільшення 81 000x) та градієнтом дефокусування від -0,8 до -2,2 мкм. Відеозапис проводився зі швидкістю 40 кадрів на секунду за допомогою мікроскопа Latitude S (Gatan) з номінальною потужністю дози 25 е–px−1 с−1, часом експозиції 2,4 с та загальною дозою приблизно 60 е–Å−2.
Корекцію руху, індукованого променем, та дозове зважування виконували на плівці за допомогою MotionCor2 у RELION 4.061. Оцінку параметра передавальної функції контрасту (CTF) виконували у cryoSPARC з використанням методу оцінки CTF на основі патчів62. Фотомікрографії з роздільною здатністю апроксимації CTF ≥4 Å виключали з подальшого аналізу. Як правило, підмножина з 500–1000 фотомікрографій використовувалася для вибору точок у cryoSPARC, а потім кілька раундів 2D-класифікації після фільтрації для отримання чіткого опорного зображення для вибору частинок на основі шаблону. Потім частинки екстрагували за допомогою 64-піксельних обмежувальних рамок та 4-кратного біннінгу. Було виконано кілька раундів 2D-класифікації для видалення небажаних категорій частинок. Початкову 3D-модель реконструювали за допомогою ab initio реконструкції та уточнювали за допомогою неоднорідного уточнення у cryoSPARC. 3D-класифікацію виконували у cryoSPARC або RELION на основі гетерогенності ARD. Істотної гетерогенності мембранних доменів не спостерігалося. Частинки уточнювали за допомогою методів C1 та C2; Частинки з вищою роздільною здатністю C2 вважалися симетричними відносно C2 та імпортувалися в RELION для баєсівського уточнення. Потім частинки були перенесені назад до cryoSPARC для остаточного неоднорідного та локального уточнення. Остаточна роздільна здатність та кількість частинок наведено в таблиці 1.
Під час обробки пентамерів Nan+AP ми досліджували різні методи покращення роздільної здатності мембранних доменів (особливо області пор), такі як віднімання сигналу та маскування TMD. Однак ці спроби були невдалими через потенційно екстремальний безлад в області пор та загальну гетерогенність TMD. Кінцеву роздільну здатність було розраховано за допомогою маски, автоматично згенерованої методом неоднорідної обробки в cryoSPARC, в першу чергу спрямованої на область ARD. Це досягло значно вищої роздільної здатності, ніж у мембранних доменів (особливо області VSLD).
Початкові de novo моделі апо-форм бактерій Nanchung та Inactive були спочатку згенеровані за допомогою Coot63, а моделі бактерій Nan та Iav були згенеровані за допомогою AlphaFold264 для ідентифікації областей з низькою достовірністю. Моделювання кальмодуліну базувалося на жорсткотільних апроксимаціях моделей зв'язування Ca2+ та без Ca2+ у PDB-приєднаннях 4JPZ56 та 1CFD65 відповідно. Моделі були уточнені за допомогою сферичного уточнення, щоб забезпечити правильну стереохімію та гарну геометрію. Потім фосфатидилхолін, фосфатидилетаноламін та фосфатидилсерин були змодельовані як чітко визначені ліпідні щільності, а ліганди NAM та AP були розміщені у відповідних щільностях у щільних контактах. Файли обмежень були згенеровані з рядка SMILES ізоформ за допомогою eLBOW у PHENIX66. Нарешті, моделі були уточнені в реальному просторі у PHENIX за допомогою локального пошуку по сітці та глобальної мінімізації з обмеженнями вторинної структури. Для уточнення моделі та структурного аналізу використовувався сервер MolProbity, а ілюстрації виконувалися за допомогою PyMOL та UCSF Chimera X.67,68,69 Аналіз апертури виконувався за допомогою сервера HOLE,70 а картування збереження послідовностей виконувалося за допомогою сервера Consurf.71
Статистичний аналіз було проведено за допомогою Igor Pro 6.2, Excel Office 365 та GraphPad Prism 7.0. Усі кількісні дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка (SEM). Для порівняння двох груп було використано t-критерій Стьюдента (двосторонній, непарний). Для порівняння кількох груп було використано однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA) з подальшим застосуванням post hoc тесту Даннета. *P< 0,05, **P< 0,01 та ***PЗначення < 0,001 вважалися статистично значущими залежно від розподілу даних. Значення Kd, Ki та їх асиметричні 95% довірчі інтервали були розраховані за допомогою GraphPad Prism 10.
Для отримання додаткової інформації про методологію дослідження дивіться короткий виклад звіту про портфоліо природи, посилання на який наведено в цій статті.
Початкову модель було побудовано з використанням моделей кальмодуліну з баз даних PDB 4JPZ та 1CFD. Координати були депоновані в Банку даних білків (PDB) під номерами реєстру 9NVN (Nan-Iav-CaM без ліганду), 9NVO (Nan-Iav-CaM, зв'язаний з нікотинамідом), 9NVP (Nan-Iav-CaM, зв'язаний з нікотинамідом та EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, зв'язаний з афенідолпіроліном та кальцієм), 9NVR (Nan-Iav-CaM, зв'язаний з афенідолпіроліном та EDTA) та 9NVS (Nan-pentamer, зв'язаний з афенідолпіроліном). Відповідні зображення кріоелектронної мікроскопії зберігаються в базі даних електронної мікроскопії (EMDB) під такими номерами: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без ліганду), EMD-49845 (комплекс Nan-Iav-CaM з нікотинамідом), EMD-49846 (комплекс Nan-Iav-CaM з нікотинамідом та ЕДТА), EMD-49847 (комплекс Nan-Iav-CaM з афідопіроліном та кальцієм), EMD-49848 (комплекс Nan-Iav-CaM з афідопіроліном та ЕДТА) та EMD-49849 (пентамерний комплекс Nan з афідопіроліном). У цій статті представлені необроблені дані для функціонального аналізу.
Час публікації: 28 січня 2026 р.