Антигельмінтний препарат N,N-діетил-м-толуамід (ДІТ), як повідомляється, пригнічує AChE (ацетилхолінестеразу) і має потенційні канцерогенні властивості через надмірну васкуляризацію. У цій статті ми показуємо, що DEET спеціально стимулює ендотеліальні клітини, які сприяють ангіогенезу, тим самим посилюючи ріст пухлини. DEET активує клітинні процеси, що призводять до ангіогенезу, включаючи проліферацію, міграцію та адгезію. Це пов’язано зі збільшенням продукції NO та експресії VEGF в ендотеліальних клітинах. Приглушення M3 або використання фармакологічних інгібіторів M3 скасували всі ці ефекти, що свідчить про те, що індукований DEET ангіогенез є чутливим до M3. Експерименти, що включають передачу сигналів кальцію в ендотеліальних і HEK-клітинах, які надлишково експресують рецептори М3, а також дослідження зв’язування та докінгу, вказують на те, що DEET діє як алостеричний модулятор рецепторів М3. Крім того, DEET пригнічує AChE, тим самим збільшуючи біодоступність ацетилхоліну та його зв’язування з рецепторами M3, а також посилюючи проангіогенні ефекти через алостеричну регуляцію.
Первинні ЕК були виділені з аорти швейцарських мишей. Метод вилучення було адаптовано з протоколу Кобаяші 26 . Мишачі EC культивували в середовищі EBM-2, доповненому 5% термоінактивованим FBS, до четвертого пасажу.
Вплив двох концентрацій DEET на проліферацію HUVEC, U87MG або BF16F10 аналізували за допомогою набору CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Коротко, 5,103 клітин на лунку висівали в 96-лунковий планшет, залишали прикріплюватися протягом ночі, а потім обробляли DEET протягом 24 годин. Після видалення середовища для росту додайте розчин для зв’язування барвника в кожну лунку мікропланшета та інкубуйте клітини при 37 °C протягом 30 хв. Рівні флуоресценції визначали за допомогою багатомодового пристрою для зчитування мікропланшетів Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вілдбад, Німеччина), оснащеного фільтрами збудження 485 нм і фільтрами випромінювання 530 нм.
HUVEC висівали в 96-лункові планшети з щільністю 104 клітини на лунку. Клітини обробляли DEET протягом 24 годин. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою колориметричного аналізу MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Значення оптичної щільності були отримані на багатомодовому рідері для мікропланшетів (Mithras LB940) при довжині хвилі 570 нм.
Вплив DEET вивчали за допомогою аналізів ангіогенезу in vitro. Обробка 10-8 М або 10-5 М DEET збільшила утворення довжини капілярів у HUVEC (рис. 1a, b, білі смуги). Порівняно з контрольною групою лікування концентраціями DEET в діапазоні від 10-14 до 10-5 М показало, що довжина капіляра досягла плато при 10-8 М DEET (додатковий рис. S2). Не було виявлено істотної різниці в проангіогенному ефекті in vitro HUVEC, оброблених DEET у діапазоні концентрацій 10-8 М і 10-5 М.
Щоб визначити вплив DEET на неоваскуляризацію, ми провели дослідження неоваскуляризації in vivo. Через 14 днів мишам, яким вводили ендотеліальні клітини, попередньо культивовані з 10-8 М або 10-5 М DEET, показали значне збільшення вмісту гемоглобіну (рис. 1c, білі стовпчики).
Крім того, DEET-індуковану неоваскуляризацію вивчали на мишах з ксенотрансплантатом U87MG, яким щодня (в/б) вводили DEET у дозі, яка, як відомо, індукує концентрацію в плазмі 10-5 М, що є нормальним для людей, які піддавалися впливу. у 23. Виявлені пухлини (тобто пухлини >100 мм3) спостерігалися через 14 днів після ін'єкції клітин U87MG мишам. На 28 день ріст пухлини був значно посилений у мишей, які отримували DEET, порівняно з контрольними мишами (рис. 1d, квадрати). Крім того, фарбування пухлин CD31 показало, що DEET значно збільшив площу капілярів, але не щільність мікросудин. (Рис. 1e–g).
Для визначення ролі мускаринових рецепторів у ДЕТА-індукованій проліферації використовували 10-8 М або 10-5 М ДЕТА в присутності pFHHSiD (10-7 М, селективний антагоніст рецептора М3). Лікування HUVEC. pFHHSiD повністю блокував проліферативні властивості ДЕТА в усіх концентраціях (табл. 1).
За цих умов ми також перевірили, чи DEET збільшить довжину капілярів у клітинах HUVEC. Подібним чином, pFHHSiD значно запобігав довжині капілярів, спричиненій DEET (рис. 1a, b, сірі смуги). Крім того, подібні експерименти проводилися з M3 siRNA. Хоча контрольна siRNA не була ефективною для сприяння утворенню капілярів, глушіння мускаринового рецептора M3 скасовувало здатність DEET збільшувати довжину капіляра (рис. 1a, b, чорні смуги).
Крім того, як 10-8 М або 10-5 М DEET-індукована васкуляризація in vitro, так і неоваскуляризація in vivo були повністю заблоковані pFHHSiD (рис. 1c, d, кола). Ці результати вказують на те, що DEET сприяє ангіогенезу через шлях, чутливий до селективних антагоністів рецепторів M3 або siRNA M3.
AChE є молекулярною мішенню DEET. Такі препарати, як донепезил, які діють як інгібітори AChE, можуть стимулювати ангіогенез EC in vitro та на моделях ішемії задніх кінцівок миші14. Ми перевірили вплив двох концентрацій DEET на активність ферменту AChE в HUVEC. Низькі (10-8 М) і високі (10-5 М) концентрації DEET знижували активність ендотеліальної АХЕ порівняно з контрольними умовами (рис. 2).
Обидві концентрації DEET (10-8 М і 10-5 М) знижували активність ацетилхолінестерази на HUVEC. BW284c51 (10-5 М) використовували як контроль для інгібіторів ацетилхолінестерази. Результати виражені у відсотках активності AChE на HUVEC, оброблених двома концентраціями DEET, порівняно з клітинами, обробленими носієм. Значення виражені як середнє ± SEM шести незалежних експериментів. *p <0,05 порівняно з контролем (тест множинного порівняння Крускала-Уолліса та Данна).
Оксид азоту (NO) бере участь у ангіогенному процесі 33, тому було вивчено виробництво NO у HUVEC, стимульованих DEET. Оброблена DEET ендотеліальна продукція NO була збільшена порівняно з контрольними клітинами, але досягла значущості лише при дозі 10-8 М (рис. 3c). Щоб визначити молекулярні зміни, що контролюють продукцію NO, викликану DEET, експресію та активацію eNOS аналізували за допомогою вестерн-блоттингу. Незважаючи на те, що лікування DEET не змінило експресію eNOS, воно значно збільшило фосфорилювання eNOS у його активуючому місці (Ser-1177), одночасно зменшивши його інгібуючий сайт (Thr-495) порівняно з необробленими клітинами у фосфорилюванні eNOS (рис. 3d). Крім того, співвідношення фосфорильованого eNOS у місці активації та інгібіторному місці розраховували після нормалізації кількості фосфорильованого eNOS до загальної кількості ферменту. Це співвідношення було значно збільшене в HUVEC, оброблених кожною концентрацією DEET, порівняно з необробленими клітинами (рис. 3d).
Нарешті, експресію VEGF, одного з основних проангіогенних факторів, аналізували за допомогою вестерн-блоттингу. DEET значно посилив експресію VEGF, тоді як pFHHSiD повністю блокував цю експресію.
Оскільки ефекти DEET чутливі як до фармакологічної блокади, так і до пригнічення рецепторів М3, ми перевірили гіпотезу про те, що DEET може посилити передачу сигналів кальцію. Дивно, що DEET не вдалося підвищити цитоплазматичний кальцій у HUVEC (дані не показані) та HEK/M3 (рис. 4a, b) для обох використаних концентрацій.
Час публікації: 30 грудня 2024 р