Антигельмінтний препарат N,N-діетил-м-толуамід (ДЕТА) як повідомлялося, пригнічує АХЕ (ацетилхолінестеразу) та має потенційні канцерогенні властивості через надмірну васкуляризацію. У цій статті ми показуємо, що ДЕТА специфічно стимулює ендотеліальні клітини, які сприяють ангіогенезу, тим самим збільшуючи ріст пухлини. ДЕТА активує клітинні процеси, що призводять до ангіогенезу, включаючи проліферацію, міграцію та адгезію. Це пов'язано зі збільшенням продукції NO та експресії VEGF в ендотеліальних клітинах. Пригнічення М3 або використання фармакологічних інгібіторів М3 скасовує всі ці ефекти, що свідчить про те, що ангіогенез, індукований ДЕТА, є чутливим до М3. Експерименти, що включають кальцієву сигналізацію в ендотеліальних клітинах та клітинах HEK, що надмірно експресують рецептори М3, а також дослідження зв'язування та докінгу, вказують на те, що ДЕТА діє як алостеричний модулятор рецепторів М3. Крім того, ДЕТА пригнічує АХЕ, тим самим збільшуючи біодоступність ацетилхоліну та його зв'язування з рецепторами М3, а також посилюючи проангіогенні ефекти через алостеричну регуляцію.
Первинні ендотеліальні клітини (ЕК) були виділені з аорти швейцарських мишей. Метод екстракції був адаптований з протоколу Кобаяші26. ЕК мишей культивували у середовищі EBM-2, доповненому 5% інактивованим нагріванням FBS, до четвертого пасажу.
Вплив двох концентрацій DEET на проліферацію HUVEC, U87MG або BF16F10 аналізували за допомогою набору для аналізу проліферації клітин CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Коротко кажучи, 5.103 клітин на лунку висівали в 96-лунковий планшет, залишали прикріплюватися протягом ночі, а потім обробляли DEET протягом 24 годин. Після видалення середовища для росту додавали розчин для зв'язування барвника до кожної лунки мікропланшета та інкубували клітини при 37 °C протягом 30 хвилин. Рівні флуоресценції визначали за допомогою багатомодового планшетного рідера Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вільдбад, Німеччина), оснащеного фільтрами збудження 485 нм та фільтрами випромінювання 530 нм.
HUVEC висівали в 96-лункові планшети з щільністю 10⁴ клітин на лунку. Клітини обробляли DEET протягом 24 годин. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою колориметричного MTT-аналізу (Sigma-Aldrich, M5655). Значення оптичної щільності отримували на багатомодовому планшетному рідері (Mithras LB940) при довжині хвилі 570 нм.
Вплив ДЕТА вивчали за допомогою аналізів ангіогенезу in vitro. Обробка ДЕТА у концентраціях від 10-8 М або 10-5 М збільшила формування довжини капілярів у HUVEC (рис. 1a, b, білі смуги). Порівняно з контрольною групою, обробка концентраціями ДЕТА від 10-14 до 10-5 М показала, що довжина капілярів досягла плато при 10-8 М ДЕТА (додатковий рис. S2). Не було виявлено суттєвої різниці в проангіогенному ефекті in vitro HUVEC, оброблених ДЕТА в діапазоні концентрацій 10-8 М та 10-5 М.
Щоб визначити вплив ДЕТА на неоваскуляризацію, ми провели дослідження неоваскуляризації in vivo. Через 14 днів у мишей, яким вводили ендотеліальні клітини, попередньо культивовані з 10-8 М або 10-5 М ДЕТА, спостерігалося значне збільшення вмісту гемоглобіну (рис. 1c, білі смуги).
Крім того, неоваскуляризацію, індуковану DEET, вивчали у мишей з ксенотрансплантатом U87MG, яким щодня (в/бр) вводили DEET у дозі, яка, як відомо, індукує концентрацію в плазмі 10-5 М, що є нормальним для людей, які зазнали впливу. у 23. Виявлені пухлини (тобто пухлини >100 мм3) спостерігалися через 14 днів після ін'єкції клітин U87MG мишам. На 28-й день ріст пухлини значно посилився у мишей, оброблених DEET, порівняно з контрольними мишами (рис. 1d, квадрати). Крім того, фарбування пухлин на CD31 показало, що DEET значно збільшував площу капілярів, але не щільність мікросудин. (рис. 1e–g).
Для визначення ролі мускаринових рецепторів у проліферації, індукованій DETA, використовували 10⁻⁶ M або 10⁻⁶ M DETA у присутності pFHHSiD (10⁻⁶ M, селективний антагоніст M3-рецепторів). Обробка HUVEC pFHHSiD повністю блокувала проліферативні властивості DETA при всіх концентраціях (Таблиця 1).
За цих умов ми також досліджували, чи збільшить DEET довжину капілярів у клітинах HUVEC. Аналогічно, pFHHSiD значно запобігав індукованому DEET збільшенню довжини капілярів (рис. 1a, b, сірі смуги). Крім того, аналогічні експерименти були проведені з M3 siRNA. Хоча контрольна siRNA не була ефективною у сприянні утворенню капілярів, приглушення мускаринового рецептора M3 скасувало здатність DEET збільшувати довжину капілярів (рис. 1a, b, чорні смуги).
Крім того, pFHHSiD повністю блокував як васкуляризацію, індуковану 10-8 M або 10-5 M DEET in vitro, так і неоваскуляризацію in vivo (рис. 1c, d, кола). Ці результати вказують на те, що DEET сприяє ангіогенезу через шлях, чутливий до селективних антагоністів рецепторів M3 або M3 siRNA.
АХЕ є молекулярною мішенню ДЕТА. Такі препарати, як донепезил, що діють як інгібітори АХЕ, можуть стимулювати ангіогенез ендотеліальних клітин in vitro та на моделях ішемії задніх кінцівок мишей14. Ми протестували вплив двох концентрацій ДЕТА на активність ферменту АХЕ в ендотеліальних клітинах людини (HUVEC). Низька (10-8 М) та висока (10-5 М) концентрації ДЕТА знижували активність ендотеліальної АХЕ порівняно з контрольними умовами (рис. 2).
Обидві концентрації ДЕТА (10-8 М та 10-5 М) знижували активність ацетилхолінестерази на клітинах HUVEC. BW284c51 (10-5 М) використовували як контроль для інгібіторів ацетилхолінестерази. Результати виражені у відсотках активності AChE на клітинах HUVEC, оброблених двома концентраціями ДЕТА, порівняно з клітинами, обробленими розчинником. Значення виражені як середнє ± SEM шести незалежних експериментів. *p < 0,05 порівняно з контролем (тест множинного порівняння Краскела-Уолліса та Данна).
Оксид азоту (NO) бере участь у процесі ангіогенезу 33, тому було досліджено продукцію NO у стимульованих DEET ендотеліальних клітинах HUVEC. Ендотеліальна продукція NO, оброблена DEET, була збільшена порівняно з контрольними клітинами, але досягла значущості лише при дозі 10-8 M (рис. 3c). Для визначення молекулярних змін, що контролюють продукцію NO, індуковану DEET, експресію та активацію eNOS аналізували за допомогою вестерн-блоттингу. Хоча обробка DEET не змінювала експресію eNOS, вона значно збільшила фосфорилювання eNOS у його активуючому сайті (Ser-1177), одночасно зменшуючи його інгібуючий сайт (Thr-495) порівняно з необробленими клітинами у фосфорилюванні eNOS (рис. 3d). Крім того, співвідношення фосфорильованої eNOS у сайті активації та інгібуючому сайті було розраховано після нормалізації кількості фосфорильованої eNOS до загальної кількості ферменту. Це співвідношення було значно збільшено у HUVEC, оброблених кожною концентрацією DEET, порівняно з необробленими клітинами (рис. 3d).
Нарешті, експресію VEGF, одного з основних проангіогенних факторів, аналізували за допомогою вестерн-блоттингу. DEET значно збільшував експресію VEGF, тоді як pFHHSiD повністю блокував цю експресію.
Оскільки ефекти ДЕТА чутливі як до фармакологічної блокади, так і до зниження регуляції М3-рецепторів, ми перевірили гіпотезу про те, що ДЕТА може посилювати кальцієву сигналізацію. Дивно, але ДЕТА не зміг збільшити рівень цитоплазматичного кальцію в HUVEC (дані не показані) та HEK/M3 (рис. 4a, b) для обох використаних концентрацій.
Час публікації: 30 грудня 2024 р.