У цьому дослідженні стимулюючий ефект комбінованого лікуваннярегулятори росту рослинДосліджено вплив наночастинок (2,4-D та кінетину) та оксиду заліза (Fe₃O₄-NPs) на морфогенез in vitro та утворення вторинних метаболітів у *Hypericum perforatum* L. Оптимізована обробка [2,4-D (0,5 мг/л) + кінетин (2 мг/л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/л)] значно покращила параметри росту рослин: висота рослин збільшилася на 59,6%, довжина коренів – на 114,0%, кількість бруньок – на 180,0%, а свіжа маса калюсу – на 198,3% порівняно з контрольною групою. Ця комбінована обробка також підвищила ефективність регенерації (50,85%) та збільшила вміст гіперицину на 66,6%. ГХ-МС-аналіз виявив високий вміст гіперозиду, β-патолену та цетилового спирту, що становить 93,36% від загальної площі піку, тоді як вміст загальних фенолів та флавоноїдів збільшився на цілих 80,1%. Ці результати свідчать про те, що регулятори росту рослин (РРР) та наночастинки Fe₃O₄ (Fe₃O₄-НЧ) чинять синергетичний ефект, стимулюючи органогенез та накопичення біологічно активних сполук, що є перспективною стратегією біотехнологічного вдосконалення лікарських рослин.
Звіробій (Hypericum perforatum L.), також відомий як звіробій, — це багаторічна трав'яниста рослина родини Звіробійних (Hypericum perforatum L.), яка має економічне значення.[1] Її потенційні біоактивні компоненти включають природні таніни, ксантани, флороглюцинол, нафталінедіантрон (гіперин та псевдогіперин), флавоноїди, фенольні кислоти та ефірні олії.[2,3,4] Звіробій можна розмножувати традиційними методами; однак сезонність традиційних методів, низька схожість насіння та схильність до хвороб обмежують його потенціал для великомасштабного культивування та безперервного утворення вторинних метаболітів.[1,5,6]
Таким чином, культура тканин in vitro вважається ефективним методом швидкого розмноження рослин, збереження ресурсів зародкової плазми та збільшення врожаю лікарських сполук [7, 8]. Регулятори росту рослин (РРР) відіграють вирішальну роль у регуляції морфогенезу та необхідні для культивування калюсу та цілісних організмів in vitro. Оптимізація їх концентрацій та комбінацій має вирішальне значення для успішного завершення цих процесів розвитку [9]. Тому розуміння відповідного складу та концентрації регуляторів є важливим для покращення росту та регенеративної здатності звіробою звичайного (H. perforatum) [10].
Наночастинки оксиду заліза (Fe₃O₄) – це клас наночастинок, які були або розробляються для культури тканин. Fe₃O₄ має значні магнітні властивості, добру біосумісність і здатність сприяти росту рослин і зменшувати стрес навколишнього середовища, тому він привернув значну увагу в розробці культур тканин. Потенційне застосування цих наночастинок може включати оптимізацію культури in vitro для стимулювання поділу клітин, покращення поглинання поживних речовин та активації антиоксидантних ферментів [11].
Хоча наночастинки продемонстрували хороший стимулюючий вплив на ріст рослин, дослідження спільного застосування наночастинок Fe₃O₄ та оптимізованих регуляторів росту рослин у *H. perforatum* залишаються недостатніми. Щоб заповнити цю прогалину в знаннях, це дослідження оцінило вплив їхнього комбінованого впливу на морфогенез in vitro та виробництво вторинних метаболітів, щоб надати нові знання для покращення характеристик лікарських рослин. Тому це дослідження має дві мети: (1) оптимізувати концентрацію регуляторів росту рослин для ефективного сприяння утворенню калюсу, регенерації пагонів та вкоріненню in vitro; та (2) оцінити вплив наночастинок Fe₃O₄ на параметри росту in vitro. Майбутні плани включають оцінку виживання регенерованих рослин під час акліматизації (in vitro). Очікується, що результати цього дослідження значно покращать ефективність мікророзмноження *H. perforatum*, тим самим сприяючи сталому використанню та біотехнологічному застосуванню цієї важливої лікарської рослини.
У цьому дослідженні ми отримали експлантати листя з вирощених у польових умовах однорічних рослин звіробою (материнських рослин). Ці експлантати використовувалися для оптимізації умов культивування in vitro. Перед культивуванням листя ретельно промивали під проточною дистильованою водою протягом кількох хвилин. Потім поверхні експлантатів дезінфікували шляхом занурення в 70% етанол на 30 секунд, а потім занурення в 1,5% розчин гіпохлориту натрію (NaOCl), що містив кілька крапель Tween 20, на 10 хвилин. Нарешті, експлантати тричі промивали стерильною дистильованою водою перед перенесенням у наступне середовище для культивування.
Протягом наступних чотирьох тижнів вимірювали параметри регенерації пагонів, включаючи швидкість регенерації, кількість пагонів на експлант та довжину пагона. Коли регенеровані пагони досягали довжини щонайменше 2 см, їх переносили в середовище для вкорінення, що складалося з середовища MS половинної концентрації, 0,5 мг/л індолілмасляної кислоти (IBA) та 0,3% гуарової камеді. Культивування вкорінення тривало протягом трьох тижнів, протягом яких вимірювали швидкість вкорінення, кількість коренів та довжину коренів. Кожну обробку повторювали тричі, культивуючи по 10 експлантів на повторність, що давало приблизно 30 експлантів на обробку.
Висоту рослин вимірювали в сантиметрах (см) за допомогою лінійки, від основи рослини до кінчика найвищого листка. Довжину коренів вимірювали в міліметрах (мм) одразу після обережного видалення розсади та видалення середовища для вирощування. Кількість бруньок на експлантат підраховували безпосередньо на кожній рослині. Кількість чорних плям на листках, відомих як вузлики, вимірювали візуально. Вважається, що ці чорні вузлики є залозами, що містять гіперицин, або окислювальними плямами, і використовуються як фізіологічний показник реакції рослини на обробку. Після видалення всього середовища для вирощування, свіжу вагу розсади вимірювали за допомогою електронних ваг з точністю до міліграмів (мг).
Метод розрахунку швидкості утворення калюсу полягає в наступному: після культивування експлантів у середовищі, що містить різні регулятори росту (кінази, 2,4-D та Fe3O4) протягом чотирьох тижнів, підраховують кількість експлантів, здатних утворювати калюс. Формула для розрахунку швидкості утворення калюсу така:
Кожну обробку повторювали тричі, при цьому в кожному повторенні досліджували щонайменше 10 експлантатів.
Швидкість регенерації відображає частку калюсної тканини, яка успішно завершує процес диференціації бруньок після стадії формування калюсу. Цей показник демонструє здатність калюсної тканини трансформуватися в диференційовану тканину та рости в нові органи рослини.
Коефіцієнт укорінення – це відношення кількості гілок, здатних до вкорінення, до загальної кількості гілок. Цей показник відображає успішність етапу вкорінення, що має вирішальне значення при мікророзмноженні та розмноженні рослин, оскільки гарне вкорінення допомагає саджанцям краще виживати в умовах вирощування.
Гіперицинові сполуки екстрагували 90% метанолом. П'ятдесят мг висушеної рослинної сировини додали до 1 мл метанолу та обробляли ультразвуком протягом 20 хвилин при 30 кГц в ультразвуковому очищувачі (модель A5120-3YJ) при кімнатній температурі в темряві. Після обробки ультразвуком зразок центрифугували при 6000 об/хв протягом 15 хвилин. Супернатант збирали, а поглинання гіперицину вимірювали при 592 нм за допомогою спектрофотометра Plus-3000 S згідно з методом, описаним Консейсао та ін. [14].
Більшість обробок регуляторами росту рослин (РРР) та наночастинками оксиду заліза (Fe₃O₄-NP) не викликали утворення чорних бульбочок на регенерованому листі пагонів. Бульбочок не спостерігалося при жодній з обробок 0,5 або 1 мг/л 2,4-D, 0,5 або 1 мг/л кінетину або 1, 2 або 4 мг/л наночастинок оксиду заліза. Кілька комбінацій показали незначне збільшення розвитку бульбочок (але не статистично значуще) при вищих концентраціях кінетину та/або наночастинок оксиду заліза, таких як комбінація 2,4-D (0,5–2 мг/л) з кінетином (1–1,5 мг/л) та наночастинками оксиду заліза (2–4 мг/л). Ці результати показано на рисунку 2. Чорні вузлики являють собою залози, багаті на гіперицин, як природні, так і корисні. У цьому дослідженні чорні вузлики були переважно пов'язані з побурінням тканин, що вказує на сприятливе середовище для накопичення гіперицину. Обробка наночастинками 2,4-D, кінетину та Fe₃O₄ сприяла росту калюсу, зменшенню побуріння та збільшенню вмісту хлорофілу, що свідчить про покращення метаболічної функції та потенційне зниження окислювального пошкодження [37]. У цьому дослідженні оцінювався вплив кінетину в поєднанні з наночастинками 2,4-D та Fe₃O₄ на ріст і розвиток калюсу звіробою (рис. 3a–g). Попередні дослідження показали, що наночастинки Fe₃O₄ мають протигрибкову та антимікробну активність [38, 39] і, при використанні в поєднанні з регуляторами росту рослин, можуть стимулювати захисні механізми рослин та знижувати показники клітинного стресу [18]. Хоча біосинтез вторинних метаболітів генетично регулюється, їх фактичний вихід сильно залежить від умов навколишнього середовища. Метаболічні та морфологічні зміни можуть впливати на рівень вторинних метаболітів, регулюючи експресію специфічних генів рослин та реагуючи на фактори навколишнього середовища. Крім того, індуктори можуть запускати активацію нових генів, які, у свою чергу, стимулюють ферментативну активність, зрештою активуючи численні біосинтетичні шляхи та призводячи до утворення вторинних метаболітів. Крім того, інше дослідження показало, що зменшення затінення збільшує вплив сонячного світла, тим самим підвищуючи денну температуру в природному середовищі існування *Hypericum perforatum*, що також сприяє збільшенню виходу гіперицину. На основі цих даних у цьому дослідженні досліджували роль наночастинок заліза як потенційних індукторів у культурі тканин. Результати показали, що ці наночастинки можуть активувати гени, що беруть участь у біосинтезі гесперидину, шляхом ферментативної стимуляції, що призводить до збільшення накопичення цієї сполуки (рис. 2). Отже, порівняно з рослинами, що ростуть у природних умовах, можна стверджувати, що виробництво таких сполук in vivo також може бути посилено, коли помірний стрес поєднується з активацією генів, що беруть участь у біосинтезі вторинних метаболітів. Комбіновані обробки загалом позитивно впливають на швидкість регенерації, але в деяких випадках цей ефект послаблюється. Зокрема, обробка 1 мг/л 2,4-D, 1,5 мг/л кінази та різними концентраціями може незалежно та значно збільшити швидкість регенерації на 50,85% порівняно з контрольною групою (рис. 4c). Ці результати свідчать про те, що специфічні комбінації наногормонів можуть діяти синергічно, сприяючи росту рослин та виробленню метаболітів, що має велике значення для культури тканин лікарських рослин. Палмер та Келлер [50] показали, що обробка 2,4-D може незалежно індукувати утворення калюсу у St. perforatum, тоді як додавання кінази значно посилює утворення та регенерацію калюсу. Цей ефект був зумовлений покращенням гормонального балансу та стимуляцією поділу клітин. Бал та ін. [51] виявили, що обробка Fe₃O₄-NP може незалежно посилити функцію антиоксидантних ферментів, тим самим сприяючи росту коренів у St. perforatum. Культуральні середовища, що містять наночастинки Fe₃O₄ у концентраціях 0,5 мг/л, 1 мг/л та 1,5 мг/л, покращили швидкість регенерації рослин льону [52]. Використання кінетину, 2,4-дихлорбензотіазолінону та наночастинок Fe₃O₄ значно покращило швидкість утворення калюсу та коренів, проте необхідно враховувати потенційні побічні ефекти використання цих гормонів для регенерації in vitro. Наприклад, тривале або висококонцентроване використання 2,4-дихлорбензотіазолінону чи кінетину може призвести до соматичної клональної варіації, оксидативного стресу, аномальної морфології калюсу або вітрифікації. Тому висока швидкість регенерації не обов'язково передбачає генетичну стабільність. Усі регенеровані рослини слід оцінювати за допомогою молекулярних маркерів (наприклад, RAPD, ISSR, AFLP) або цитогенетичного аналізу, щоб визначити їхню однорідність та подібність до рослин in vivo [53,54,55].
Це дослідження вперше продемонструвало, що комбіноване використання регуляторів росту рослин (2,4-D та кінетину) з наночастинками Fe₃O₄ може посилити морфогенез та накопичення ключових біоактивних метаболітів (включаючи гіперицин та гіперозид) у *Hypericum perforatum*. Оптимізований режим обробки (1 мг/л 2,4-D + 1 мг/л кінетину + 4 мг/л Fe₃O₄-NP) не тільки максимізував утворення калюсу, органогенез та вихід вторинних метаболітів, але й продемонстрував легкий індукуючий ефект, потенційно покращуючи стійкість рослини до стресу та її лікарську цінність. Поєднання нанотехнологій та культури рослинних тканин забезпечує стійку та ефективну платформу для великомасштабного виробництва лікарських сполук in vitro. Ці результати прокладають шлях для промислового застосування та майбутніх досліджень молекулярних механізмів, оптимізації дозування та генетичної точності, тим самим пов'язуючи фундаментальні дослідження лікарських рослин з практичною біотехнологією.
Час публікації: 12 грудня 2025 р.