Ріст апікальної меристеми (SAM) пагона є критично важливим для архітектури стебла. Рослинні гормонигібереліни(ГА) відіграють ключову роль у координації росту рослин, але їхня роль у SAM залишається недостатньо вивченою. Тут ми розробили раціометричний біосенсор сигналізації ГА, модифікуючи білок DEL для пригнічення його важливої регуляторної функції в транскрипційній відповіді ГА, зберігаючи при цьому його деградацію при розпізнаванні ГА. Ми демонструємо, що цей біосенсор на основі деградації точно реєструє зміни рівнів ГА та клітинного сприйняття під час розвитку. Ми використовували цей біосенсор для картування активності сигналізації ГА в SAM. Ми показуємо, що високі сигнали ГА присутні переважно в клітинах, розташованих між зачатками органів, які є попередниками клітин міжвузля. Використовуючи підходи посилення та втрати функції, ми додатково демонструємо, що ГА регулює орієнтацію площини поділу клітин, встановлюючи канонічну клітинну організацію міжвузлів, тим самим сприяючи специфікації міжвузлів у SAM.
Апікальна меристема пагона (АПМ), розташована на верхівці пагона, містить нішу стовбурових клітин, активність яких модульно та ітеративно генерує бічні органи та стеблові вузли протягом усього життя рослини. Кожна з цих повторюваних одиниць, або рослинних вузлів, включає міжвузля та бічні органи у вузлах, а також пазушні меристеми в пазухах листків1. Ріст та організація рослинних вузлів змінюються під час розвитку. У Arabidopsis ріст міжвузлів пригнічується під час вегетативної стадії, а пазушні меристеми залишаються в стані спокою в пазухах листків розетки. Під час переходу до фази цвітіння АПМ стає меристемою суцвіття, генеруючи видовжені міжвузля та пазушні бруньки, гілочки в пазухах стеблових листків, а пізніше - безлисті квіти2. Хоча ми досягли значного прогресу в розумінні механізмів, що контролюють зародження листя, квіток та гілок, відносно мало відомо про те, як виникають міжвузля.
Розуміння просторово-часового розподілу ГА допоможе краще зрозуміти функції цих гормонів у різних тканинах та на різних стадіях розвитку. Візуалізація деградації злиття RGA-GFP, експресованого під дією власного промотора, надає важливу інформацію про регуляцію загального рівня ГА в коренях15,16. Однак експресія RGA варіюється в різних тканинах17 та регулюється ГА18. Таким чином, диференціальна експресія промотора RGA може призводити до картини флуоресценції, що спостерігається з RGA-GFP, і тому цей метод не є кількісним. Зовсім недавно біоактивний флуоресцеїн (Fl)-мічений GA19,20 виявив накопичення ГА в ендокортексі кореня та регуляцію його клітинних рівнів шляхом транспорту ГА. Нещодавно датчик GA FRET nlsGPS1 показав, що рівні ГА корелюють з видовженням клітин у коренях, нитках та темних гіпокотилях21. Однак, як ми бачили, концентрація ГА не є єдиним параметром, що контролює активність сигналізації ГА, оскільки вона залежить від складних процесів сенсорики. Тут, спираючись на наше розуміння сигнальних шляхівella та GA, ми повідомляємо про розробку та характеристику раціометричного біосенсора на основі деградації для сигналізації GA. Для розробки цього кількісного біосенсора ми використовували мутантний GA-чутливий RGA, який був злитий з флуоресцентним білком та повсюдно експресований у тканинах, а також GA-нечутливий флуоресцентний білок. Ми показуємо, що злиття мутантних білків RGA не перешкоджає ендогенній сигналізації GA при повсюдній експресії, і що цей біосенсор може кількісно визначити сигнальну активність, що виникає як в результаті введення GA, так і обробки сигналу GA сенсорним апаратом з високою просторово-часовою роздільною здатністю. Ми використовували цей біосенсор для картування просторово-часового розподілу сигнальної активності GA та кількісного визначення того, як GA регулює клітинну поведінку в епідермісі SAM. Ми демонструємо, що GA регулює орієнтацію площини поділу клітин SAM, розташованих між зачатками органів, тим самим визначаючи канонічну клітинну організацію міжвузля.
Зрештою, ми запитали, чи може qmRGA повідомляти про зміни рівнів ендогенної GA, використовуючи зростаючі гіпокотилі. Раніше ми показали, що нітрати стимулюють ріст, збільшуючи синтез GA та, своєю чергою, деградацію PE34. Відповідно, ми спостерігали, що довжина гіпокотилю у розсаді pUBQ10::qmRGA, вирощеній за рясного забезпечення нітратами (10 мМ NO3−), була значно більшою, ніж у розсади, вирощеної в умовах дефіциту нітратів (Додатковий рис. 6a). Відповідно до реакції росту, сигнали GA були вищими в гіпокотилях розсади, вирощеної за умов 10 мМ NO3−, ніж у розсади, вирощеної за відсутності нітратів (Додатковий рис. 6b, c). Таким чином, qmRGA також дозволяє моніторити зміни в сигналізації GA, викликані ендогенними змінами концентрації GA.
Щоб зрозуміти, чи залежить сигнальна активність GA, виявлена за допомогою qmRGA, від концентрації GA та сприйняття GA, як очікувалося виходячи з конструкції сенсора, ми проаналізували експресію трьох рецепторів GID1 у вегетативних та репродуктивних тканинах. У розсаді репортерна лінія GID1-GUS показала, що GID1a та c були високо експресовані в сім'ядолях (рис. 3a–c). Крім того, всі три рецептори експресувалися в листках, зачатках бічних коренів, кінчиках коренів (за винятком кореневого чохлика GID1b) та судинній системі (рис. 3a–c). У суцвіття SAM ми виявили сигнали GUS лише для GID1b та 1c (додатковий рис. 7a–c). Гібридизація in situ підтвердила ці патерни експресії та додатково продемонструвала, що GID1c рівномірно експресувався на низьких рівнях у SAM, тоді як GID1b демонстрував вищу експресію на периферії SAM (додатковий рис. 7d–l). Трансляційне злиття pGID1b::2xmTQ2-GID1b також виявило ступінчастий діапазон експресії GID1b, від низької або відсутньої експресії в центрі SAM до високої експресії на межах органів (Додатковий рис. 7m). Таким чином, рецептори GID1 не рівномірно розподілені по тканинах та всередині них. У наступних експериментах ми також спостерігали, що надмірна експресія GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) підвищила чутливість qmRGA в гіпокотилях до зовнішнього застосування GA (рис. 3d, e). Навпаки, флуоресценція, виміряна за допомогою qd17mRGA в гіпокотилі, була нечутливою до обробки GA3 (рис. 3f, g). Для обох аналізів проростки обробляли високими концентраціями GA (100 мкМ GA3) для оцінки швидкої поведінки сенсора, де здатність зв'язуватися з рецептором GID1 посилювалася або втрачалася. Разом ці результати підтверджують, що біосенсор qmRGA виконує комбіновану функцію як сенсор GA та GA, і свідчать про те, що диференціальна експресія рецептора GID1 може суттєво модулювати випромінювальну здатність сенсора.
На сьогоднішній день розподіл сигналів GA в SAM залишається незрозумілим. Тому ми використовували рослини, що експресують qmRGA, та репортер стовбурових клітин pCLV3::mCherry-NLS35 для розрахунку кількісних карт сигнальної активності GA з високою роздільною здатністю, зосереджуючись на шарі L1 (епідерміс; рис. 4a, b, див. Методи та додаткові методи), оскільки L1 відіграє ключову роль у контролі росту SAM36. Тут експресія pCLV3::mCherry-NLS забезпечила фіксовану геометричну точку відліку для аналізу просторово-часового розподілу сигнальної активності GA37. Хоча GA вважається важливою для розвитку латеральних органів4, ми спостерігали, що сигнали GA були низькими у флористичному зачатку (P), починаючи зі стадії P3 (рис. 4a, b), тоді як молоді зачатки P1 та P2 мали помірну активність, подібну до такої в центральній області (рис. 4a, b). Вищу сигнальну активність GA було виявлено на межах зачатків органів, починаючи з P1/P2 (з боків межі) та досягаючи піку на P4, а також у всіх клітинах периферичної області, розташованої між зачатками (рис. 4a, b та додатковий рис. 8a, b). Ця вища сигнальна активність GA спостерігалася не лише в епідермісі, але й у шарах L2 та верхніх L3 (додатковий рис. 8b). Характер сигналів GA, виявлених у SAM за допомогою qmRGA, також залишався незмінним з часом (додатковий рис. 8c–f, k). Хоча конструкція qd17mRGA була систематично знижена в SAM рослин T3 з п'яти незалежних ліній, які ми детально охарактеризували, ми змогли проаналізувати флуоресцентні патерни, отримані за допомогою конструкції pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (додатковий рис. 8g–j, l). У цій контрольній лінії були виявлені лише незначні зміни у співвідношенні флуоресценції в SAM, але в центрі SAM ми спостерігали чітке та несподіване зниження VENUS, пов'язане з TagBFP. Це підтверджує, що сигнальний патерн, що спостерігається qmRGA, відображає GA-залежну деградацію mRGA-VENUS, але також демонструє, що qmRGA може переоцінювати сигнальну активність GA в центрі меристеми. Підсумовуючи, наші результати показують сигнальний патерн GA, який в першу чергу відображає розподіл зачатків. Такий розподіл міжзачаткової області (IPR) зумовлений поступовим встановленням високої сигнальної активності GA між зачатком, що розвивається, та центральною областю, водночас сигнальна активність GA в зачатку зменшується (рис. 4c, d).
Розподіл рецепторів GID1b та GID1c (див. вище) свідчить про те, що диференціальна експресія рецепторів GA допомагає формувати характер сигнальної активності GA в SAM. Ми задавалися питанням, чи може бути пов'язане диференціальне накопичення GA. Щоб дослідити цю можливість, ми використали датчик FRET nlsGPS1 GA21. Підвищена частота активації була виявлена в SAM nlsGPS1, обробленого 10 мкМ GA4+7 протягом 100 хвилин (Додатковий рис. 9a–e), що вказує на те, що nlsGPS1 реагує на зміни концентрації GA в SAM, як і в коренях21. Просторовий розподіл частоти активації nlsGPS1 виявив відносно низькі рівні GA у зовнішніх шарах SAM, але показав, що вони були підвищені в центрі та на межах SAM (Рис. 4e та Додатковий рис. 9a,c). Це свідчить про те, що GA також розподілена в SAM з просторовою схемою, порівнянною з тією, що виявлена за допомогою qmRGA. Як додатковий підхід, ми також обробили SAM флуоресцентним GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) або лише Fl як негативний контроль. Сигнал Fl був розподілений по всьому SAM, включаючи центральну область та зачаток, хоча й з нижчою інтенсивністю (рис. 4j та додатковий рис. 10d). Навпаки, всі три GA-Fl накопичувалися специфічно в межах зачатка та різною мірою в решті IPR, причому GA7-Fl накопичувався в найбільшому домені в IPR (рис. 4k та додатковий рис. 10a,b). Кількісна оцінка інтенсивності флуоресценції показала, що співвідношення інтенсивності IPR до інтенсивності без IPR було вищим у SAM, обробленому GA-Fl, порівняно з SAM, обробленим Fl (рис. 4l та додатковий рис. 10c). Разом ці результати свідчать про те, що GA присутній у вищих концентраціях у клітинах IPR, розташованих найближче до межі органу. Це свідчить про те, що характер сигнальної активності SAM GA є результатом як диференціальної експресії рецепторів GA, так і диференціального накопичення GA в клітинах IPR поблизу меж органу. Таким чином, наш аналіз виявив неочікувану просторово-часову закономірність передачі сигналів GA з нижчою активністю в центрі та зачатку SAM та вищою активністю в IPR у периферичній області.
Щоб зрозуміти роль диференціальної сигнальної активності GA в SAM, ми проаналізували кореляцію між сигнальною активністю GA, розширенням клітин та поділом клітин, використовуючи покадрову візуалізацію в реальному часі за допомогою SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Враховуючи роль GA в регуляції росту, очікувалася позитивна кореляція з параметрами розширення клітин. Тому ми спочатку порівняли карти сигнальної активності GA з картами швидкості росту поверхні клітин (як показник сили розширення клітин для даної клітини та для дочірніх клітин під час поділу) та з картами анізотропії росту, яка вимірює спрямованість розширення клітин (також використовується тут для даної клітини та для дочірніх клітин під час поділу; рис. 5a,b, див. Методи та додаткові методи). Наші карти швидкості росту поверхні клітин SAM узгоджуються з попередніми спостереженнями38,39, з мінімальними темпами росту на межі та максимальними темпами росту в квітках, що розвиваються (рис. 5a). Аналіз головних компонентів (PCA) показав, що сигнальна активність GA негативно корелює з інтенсивністю росту поверхні клітин (рис. 5c). Ми також показали, що основні осі варіації, включаючи вхідний сигнал GA та інтенсивність росту, були ортогональними до напрямку, визначеного високою експресією CLV3, що підтверджує виключення клітин із центру SAM в решті аналізів. Кореляційний аналіз Спірмена підтвердив результати PCA (Рисунок 5d), вказуючи на те, що вищі сигнали GA в IPR не призвели до більшого розширення клітин. Однак кореляційний аналіз виявив незначну позитивну кореляцію між активністю сигналізації GA та анізотропією росту (Рисунок 5c, d), що свідчить про те, що вища сигналізація GA в IPR впливає на напрямок росту клітин і, можливо, на положення площини поділу клітин.
a, b Теплові карти середнього поверхневого росту (a) та анізотропії росту (b) у SAM, усереднені для семи незалежних рослин (використовувані як показники сили та напрямку розширення клітин відповідно). c PCA-аналіз включав такі змінні: сигнал GA, інтенсивність поверхневого росту, анізотропія поверхневого росту та експресія CLV3. Компонент PCA 1 переважно негативно корелював з інтенсивністю поверхневого росту та позитивно корелював з сигналом GA. Компонент PCA 2 переважно позитивно корелював з анізотропією поверхневого росту та негативно корелював з експресією CLV3. Відсотки представляють варіацію, пояснену кожним компонентом. d Кореляційний аналіз Спірмена між сигналом GA, інтенсивністю поверхневого росту та анізотропією поверхневого росту в масштабі тканини, за винятком CZ. Число праворуч – це значення rho Спірмена між двома змінними. Зірочки вказують на випадки, коли кореляція/негативна кореляція є дуже значущою. e 3D-візуалізація клітин Col-0 SAM L1 за допомогою конфокальної мікроскопії. Нові клітинні стінки, утворені в SAM (але не в зачатку) через 10 годин, забарвлені відповідно до значень їх кутів. Кольорова шкала показана в правому нижньому куті. На вставці показано відповідне 3D-зображення о 0 год. Експеримент повторили двічі з подібними результатами. f Коробчасті діаграми показують швидкість поділу клітин в IPR та non-IPR Col-0 SAM (n = 10 незалежних рослин). Центральна лінія показує медіану, а межі прямокутників вказують на 25-й та 75-й процентилі. Вуса вказують на мінімальне та максимальне значення, визначені за допомогою програмного забезпечення R. Значення P були отримані за допомогою двостороннього t-критерію Велча. g, h Схематична діаграма, що показує (g), як виміряти кут нової клітинної стінки (пурпуровий) відносно радіального напрямку від центру SAM (біла пунктирна лінія) (враховуються лише значення гострого кута, тобто 0–90°), та (h) окружний/латеральний та радіальний напрямки в межах меристеми. i Частотні гістограми орієнтації площини поділу клітин по SAM (темно-синій), IPR (середньо-синій) та non-IPR (світло-синій) відповідно. Значення P були отримані за допомогою двостороннього тесту Колмогорова-Смірнова. Експеримент повторили двічі з подібними результатами. j Частотні гістограми орієнтації площини поділу клітин IPR навколо P3 (світло-зелений), P4 (середньо-зелений) та P5 (темно-зелений) відповідно. Значення P були отримані за допомогою двостороннього тесту Колмогорова-Смірнова. Експеримент повторили двічі з подібними результатами.
Тому ми далі досліджували кореляцію між сигналізацією GA та активністю поділу клітин, ідентифікуючи новоутворені клітинні стінки під час аналізу (рис. 5e). Цей підхід дозволив нам виміряти частоту та напрямок поділу клітин. На диво, ми виявили, що частота поділів клітин в IPR та решті SAM (не-IPR, рис. 5f) була подібною, що вказує на те, що відмінності в сигналізації GA між клітинами IPR та не-IPR суттєво не впливають на поділ клітин. Це, а також позитивна кореляція між сигналізацією GA та анізотропією росту, спонукали нас розглянути питання про те, чи може активність сигналізації GA впливати на орієнтацію площини поділу клітин. Ми виміряли орієнтацію нової клітинної стінки як гострий кут відносно радіальної осі, що з'єднує центр меристеми та центр нової клітинної стінки (рис. 5e-i) та спостерігали чітку тенденцію до поділу клітин під кутами, близькими до 90° відносно радіальної осі, з найвищими частотами, що спостерігалися при 70–80° (23,28%) та 80–90° (22,62%) (рис. 5e,i), що відповідає поділу клітин у окружному/поперечному напрямку (рис. 5h). Щоб дослідити внесок сигналізації GA у таку поведінку поділу клітин, ми проаналізували параметри поділу клітин в IPR та non-IPR окремо (рис. 5i). Ми спостерігали, що розподіл кутів поділу в клітинах IPR відрізнявся від розподілу в клітинах без IPR або в клітинах усього SAM, причому клітини IPR демонстрували вищу частку латеральних/кільцевих поділів клітин, тобто 70–80° та 80–90° (33,86% та 30,71% відповідно, відповідні пропорції) (рис. 5i). Таким чином, наші спостереження виявили зв'язок між високою сигналізацією GA та орієнтацією площини поділу клітин, близькою до окружного напрямку, подібно до кореляції між активністю сигналізації GA та анізотропією росту (рис. 5c, d). Щоб додатково встановити просторову консервативність цього зв'язку, ми виміряли орієнтацію площини поділу в клітинах IPR, що оточують зачаток, починаючи з P3, оскільки найвища активність сигналізації GA була виявлена в цій області, починаючи з P4 (рис. 4). Кути поділу IPR навколо P3 та P4 не показали статистично значущих відмінностей, хоча спостерігалася підвищена частота латеральних поділів клітин в IPR навколо P4 (рис. 5j). Однак, у клітинах IPR навколо P5 різниця в орієнтації площини поділу клітин стала статистично значущою, з різким збільшенням частоти поперечних поділів клітин (рис. 5j). Разом ці результати свідчать про те, що сигналізація GA може контролювати орієнтацію поділів клітин у SAM, що узгоджується з попередніми повідомленнями40,41 про те, що висока сигналізація GA може індукувати латеральну орієнтацію поділів клітин в IPR.
Передбачається, що клітини в IPR не будуть включені в зачатки, а радше в міжвузля2,42,43. Поперечна орієнтація клітинних поділів в IPR може призвести до типової організації паралельних поздовжніх рядів епідермальних клітин у міжвузлях. Наші спостереження, описані вище, свідчать про те, що сигналізація GA, ймовірно, відіграє певну роль у цьому процесі, регулюючи напрямок поділу клітин.
Втрата функції кількох генів DELA призводить до конститутивної відповіді GA, і мутанти della можна використовувати для перевірки цієї гіпотези44. Спочатку ми проаналізували патерни експресії п'яти генів DELA в SAM. Транскрипційне злиття лінії GUS45 показало, що GAI, RGA, RGL1 та RGL2 (у значно меншій мірі) експресувалися в SAM (Додатковий рис. 11a–d). Гібридизація in situ додатково продемонструвала, що мРНК GAI накопичується специфічно в зачатках та квітках, що розвиваються (Додатковий рис. 11e). мРНК RGL1 та RGL3 були виявлені по всьому пологу SAM та у старіших квітках, тоді як мРНК RGL2 була більш поширеною в прикордонній області (Додатковий рис. 11f–h). Конфокальна візуалізація pRGL3::RGL3-GFP SAM підтвердила експресію, що спостерігається за допомогою гібридизації in situ, та показала, що білок RGL3 накопичується в центральній частині SAM (Додатковий рис. 11i). Використовуючи лінію pRGA::GFP-RGA, ми також виявили, що білок RGA накопичується в SAM, але його кількість зменшується на межі, починаючи з P4 (Додатковий рис. 11j). Примітно, що патерни експресії RGL3 та RGA узгоджуються з вищою сигнальною активністю GA в IPR, що було виявлено за допомогою qmRGA (рис. 4). Більше того, ці дані вказують на те, що всі DALL експресуються в SAM і що їхня експресія разом охоплює весь SAM.
Далі ми проаналізували параметри поділу клітин у SAM дикого типу (Ler, контроль) та п'ятикратних (глобальних) мутантів gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глобальних) (рис. 6a, b). Цікаво, що ми спостерігали статистично значуще зміщення в розподілі частот кутів поділу клітин у SAM della global мутанта порівняно з диким типом (рис. 6c). Ця зміна у мутанта della global була зумовлена збільшенням частоти кутів 80–90° (34,71% проти 24,55%) та, меншою мірою, кутів 70–80° (23,78% проти 20,18%), тобто відповідає поперечним поділам клітин (рис. 6c). Частота непоперечних поділів (0–60°) також була нижчою у мутанта della global (рис. 6c). Частота поперечних поділів клітин була значно збільшена в SAM мутанта della global (рис. 6b). Частота поперечних поділів клітин в IPR також була вищою у мутанта della global порівняно з диким типом (рис. 6d). Поза областю IPR дикий тип мав більш рівномірний розподіл кутів поділу клітин, тоді як мутант della global віддавав перевагу тангенціальним поділам, подібним до IPR (рис. 6e). Ми також кількісно визначили орієнтацію поділів клітин у SAM п'ятикратних мутантів ga2 оксидази (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 та ga2ox6-2), що є GA-неактивним мутантом, в якому накопичується GA. Відповідно до збільшення рівнів GA, SAM п'ятиразового мутантного суцвіття ga2ox був більшим, ніж у Col-0 (Додатковий рис. 12a, b), і порівняно з Col-0, п'ятиразовий ga2ox SAM демонстрував чітко інший розподіл кутів поділу клітин, при цьому частота кутів збільшувалася від 50° до 90°, тобто знову ж таки на користь тангенціальних поділів (Додатковий рис. 12a–c). Таким чином, ми показуємо, що конститутивна активація сигналізації GA та накопичення GA індукують латеральні поділи клітин в IPR та решті SAM.
a, b 3D-візуалізація шару L1 SAM, забарвленого PI, Ler (a) та глобального мутанта della (b), за допомогою конфокальної мікроскопії. Нові клітинні стінки, що утворилися в SAM (але не в зачатку) протягом 10-годинного періоду, показані та забарвлені відповідно до значень їх кутів. На вставці показано SAM о 0 год. Кольорова шкала відображається в правому нижньому куті. Стрілка в (b) вказує на приклад вирівняних файлів клітин у глобальному мутанті della. Експеримент повторювали двічі з подібними результатами. ce порівняння розподілу частот орієнтацій площин поділу клітин у всьому SAM (d), IPR (e) та не-IPR (f) між Ler та глобальною della. Значення P були отримані за допомогою двостороннього тесту Колмогорова-Смірнова. f, g 3D-візуалізація конфокальних зображень SAM, забарвленого PI, трансгенних рослин Col-0 (i) та pCUC2::gai-1-VENUS (j). На панелях (a, b) показано нові клітинні стінки (але не зачатки), що утворилися в SAM протягом 10 годин. Експеримент повторили двічі з подібними результатами. h–j Порівняння розподілу частоти орієнтацій площин поділу клітин, розташованих у всьому SAM (h), IPR (i) та не-IPR (j) між рослинами Col-0 та pCUC2::gai-1-VENUS. Значення P були отримані за допомогою двостороннього тесту Колмогорова-Смірнова.
Далі ми протестували ефект пригнічення сигналізації GA саме в IPR. Для цього ми використали промотор котиледонської чашки 2 (CUC2) для стимуляції експресії домінантно-негативного білка gai-1, злитого з VENUS (у лінії pCUC2::gai-1-VENUS). У SAM дикого типу промотор CUC2 керує експресією більшості IPR в SAM, включаючи прикордонні клітини, починаючи з P4, і подібна специфічна експресія спостерігалася у рослин pCUC2::gai-1-VENUS (див. нижче). Розподіл кутів поділу клітин по SAM або IPR рослин pCUC2::gai-1-VENUS суттєво не відрізнявся від розподілу дикого типу, хоча несподівано ми виявили, що клітини без IPR у цих рослинах ділилися з вищою частотою 80–90° (рис. 6f–j).
Було висловлено припущення, що напрямок поділу клітин залежить від геометрії SAM, зокрема від напруження розтягування, що генерується викривленням тканини46. Тому ми запитали, чи змінювалася форма SAM у рослинах della global мутанта та pCUC2::gai-1-VENUS. Як повідомлялося раніше12, розмір SAM мутанта della global був більшим, ніж у дикого типу (Додатковий рис. 13a, b, d). Гібридизація in situ РНК CLV3 та STM підтвердила розширення меристеми у мутантів della та додатково показала латеральне розширення ніші стовбурових клітин (Додатковий рис. 13e, f, h, i). Однак, викривлення SAM було подібним в обох генотипах (Додатковий рис. 13k, m, n, p). Ми спостерігали подібне збільшення розміру у чотириразового мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без зміни викривлення порівняно з диким типом (Додатковий рис. 13c, d, g, j, l, o, p). Частота орієнтації поділів клітин також була змінена у квадрупольного мутанта della, але меншою мірою, ніж у монолітного мутанта della (Додатковий рис. 12d–f). Цей ефект дозування, разом з відсутністю впливу на кривизну, свідчить про те, що залишкова активність RGL3 у квадрупольному мутанті Della обмежує зміни в орієнтації поділу клітин, спричинені втратою активності DELLA, і що зміни в латеральних поділах клітин відбуваються у відповідь на зміни в сигнальній активності GA, а не на зміни в геометрії SAM. Як описано вище, промотор CUC2 керує експресією IPR у SAM, починаючи з P4 (Додатковий рис. 14a, b), і навпаки, pCUC2::gai-1-VENUS SAM мав зменшений розмір, але вищу кривизну (Додатковий рис. 14c–h). Ця зміна морфології pCUC2::gai-1-VENUS SAM може призвести до іншого розподілу механічних напружень порівняно з диким типом, у якому високі окружні напруження починаються на меншій відстані від центру SAM47. Як варіант, зміни морфології pCUC2::gai-1-VENUS SAM можуть бути результатом змін регіональних механічних властивостей, індукованих експресією трансгену48. В обох випадках це може частково компенсувати вплив змін сигналізації GA, збільшуючи ймовірність того, що клітини будуть ділитися в окружній/поперечній орієнтації, що пояснює наші спостереження.
У сукупності наші дані підтверджують, що вища сигналізація GA відіграє активну роль у латеральній орієнтації площини поділу клітин в IPR. Вони також показують, що кривизна меристеми також впливає на орієнтацію площини поділу клітин в IPR.
Поперечна орієнтація площини поділу в IPR, зумовлена високою активністю сигналізації GA, свідчить про те, що GA попередньо організовує радіальний клітинний файл в епідермісі в межах SAM, щоб визначити клітинну організацію, яка пізніше буде знайдена в епідермальному міжвузлі. Дійсно, такі клітинні файли часто були помітні на зображеннях SAM мутантів della global (рис. 6b). Таким чином, для подальшого дослідження розвитку функції просторового патерну сигналізації GA в SAM ми використовували покадрову зйомку для аналізу просторової організації клітин в IPR у рослин дикого типу (Ler та Col-0), мутантів della global та трансгенних рослин pCUC2::gai-1-VENUS.
Ми виявили, що qmRGA показав, що активність сигналізації GA в IPR зростала від P1/P2 до піку на P4, і ця закономірність залишалася постійною з часом (рис. 4a–f та додатковий рис. 8c–f, k). Щоб проаналізувати просторову організацію клітин в IPR зі збільшенням сигналу GA, ми позначили клітини Ler IPR вище та з боків P4 відповідно до їхньої долі розвитку, проаналізованої через 34 години після першого спостереження, тобто більше двох пластидних часів, що дозволило нам відстежувати клітини IPR під час розвитку зачатка від P1/P2 до P4. Ми використовували три різні кольори: жовтий для тих клітин, які були інтегровані в зачаток поблизу P4, зелений для тих, що були в IPR, та фіолетовий для тих, що брали участь в обох процесах (рис. 7a–c). При t0 (0 год) 1–2 шари клітин IPR були видимі перед P4 (рис. 7a). Як і очікувалося, коли ці клітини ділилися, вони робили це переважно через поперечну площину поділу (рис. 7a–c). Подібні результати були отримані з використанням Col-0 SAM (зосереджуючись на P3, межа якого складається подібно до P4 у Ler), хоча в цьому генотипі складка, утворена на квітковій межі, швидше приховувала клітини IPR (рис. 7g–i). Таким чином, схема поділу клітин IPR попередньо організовує клітини в радіальні ряди, як у міжвузлях. Організація радіальних рядів та локалізація клітин IPR між послідовними органами свідчать про те, що ці клітини є міжвузловими клітинами-попередниками.
Тут ми розробили ратиометричний біосенсор сигналізації GA, qmRGA, який дозволяє кількісно картувати сигнальну активність GA, що виникає внаслідок комбінованих концентрацій GA та рецепторів GA, мінімізуючи при цьому втручання в ендогенні сигнальні шляхи, тим самим надаючи інформацію про функцію GA на клітинному рівні. З цією метою ми сконструювали модифікований білок DNA, mRGA, який втратив здатність зв'язуватися з партнерами взаємодії DNA, але залишається чутливим до протеолізу, індукованого GA. qmRGA реагує як на екзогенні, так і на ендогенні зміни рівнів GA, а його динамічні сенсорні властивості дозволяють оцінювати просторово-часові зміни сигнальної активності GA під час розвитку. qmRGA також є дуже гнучким інструментом, оскільки його можна адаптувати до різних тканин шляхом зміни промотора, що використовується для його експресії (за необхідності), і враховуючи консервативний характер сигнального шляху GA та мотиву PFYRE у покритонасінних рослин, він, ймовірно, може бути перенесений на інші види22. Відповідно до цього, еквівалентна мутація в білку рису SLR1SA (HYY497AAA) також показала пригнічення репресорної активності росту SLR1, лише незначно зменшуючи його GA-опосередковану деградацію, подібно до mRGA23. Примітно, що нещодавні дослідження Arabidopsis показали, що мутація однієї амінокислоти в домені PFYRE (S474L) змінила транскрипційну активність RGA, не впливаючи на його здатність взаємодіяти з партнерами транскрипційних факторів50. Хоча ця мутація дуже близька до 3 амінокислотних замін, присутніх у mRGA, наші дослідження показують, що ці дві мутації змінюють різні характеристикиSA. Хоча більшість партнерів транскрипційних факторів зв'язуються з доменами LHR1 та SAW26,51, деякі консервативні амінокислоти в домені PFYRE можуть допомогти стабілізувати ці взаємодії.
Розвиток міжвузлів є ключовою ознакою архітектури рослин та підвищення врожайності. qmRGA виявив вищу активність сигналізації GA у клітинах-попередниках міжвузлів IPR. Поєднуючи кількісну візуалізацію та генетику, ми показали, що патерни сигналізації GA накладаються на кругові/поперечні площини поділу клітин в епідермісі SAM, формуючи організацію поділу клітин, необхідну для розвитку міжвузлів. Під час розвитку було виявлено кілька регуляторів орієнтації площини поділу клітин52,53. Наша робота надає чіткий приклад того, як активність сигналізації GA регулює цей клітинний параметр.PE може взаємодіяти з білковими комплексами перед згортанням41, тому сигналізація GA може регулювати орієнтацію площини поділу клітин, безпосередньо впливаючи на орієнтацію кортикальних мікротрубочок40,41,54,55. Ми несподівано показали, що в SAM корелятом вищої активності сигналізації GA було не подовження або поділ клітин, а лише анізотропія росту, що узгоджується з прямим впливом GA на напрямок поділу клітин в IPR. Однак ми не можемо виключати, що цей ефект також може бути непрямим, наприклад, опосередкованим розм'якшенням клітинної стінки, індукованим GA56. Зміни властивостей клітинної стінки викликають механічне напруження57,58, яке також може впливати на орієнтацію площини поділу клітин, впливаючи на орієнтацію кортикальних мікротрубочок39,46,59. Комбінований вплив механічного напруження, індукованого GA, та прямої регуляції орієнтації мікротрубочок GA може бути задіяний у формуванні специфічного патерну орієнтації поділу клітин в IPR для визначення міжвузлів, і для перевірки цієї ідеї необхідні подальші дослідження. Аналогічно, попередні дослідження підкреслили важливість білків TCP14 та 15, що взаємодіють з DNA, у контролі формування міжвузлів60,61, і ці фактори можуть опосередковувати дію GA разом з BREVIPEDICELLUS (BP) та PENNYWISE (PNY), які регулюють розвиток міжвузлів і, як було показано, впливають на сигналізацію GA2,62. Враховуючи, що ДЕЛЛА взаємодіють із сигнальними шляхами брасиностероїдів, етилену, жасмонової кислоти та абсцизової кислоти (АБК)63,64, і що ці гормони можуть впливати на орієнтацію мікротрубочок65, вплив ГА на орієнтацію клітинного поділу також може бути опосередкований іншими гормонами.
Ранні цитологічні дослідження показали, що як внутрішні, так і зовнішні області SAM Arabidopsis необхідні для розвитку міжвузлів2,42. Той факт, що GA активно регулює поділ клітин у внутрішніх тканинах12, підтверджує подвійну функцію GA у регулюванні розміру меристеми та міжвузлів у SAM. Характер спрямованого поділу клітин також жорстко регулюється у внутрішній тканині SAM, і ця регуляція є важливою для росту стебла52. Буде цікаво дослідити, чи відіграє GA також роль в орієнтації площини поділу клітин у внутрішній організації SAM, тим самим синхронізуючи специфікацію та розвиток міжвузлів у SAM.
Рослини вирощували in vitro у ґрунті або середовищі 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa), доповненому 1% сахарози та 1% агару (Sigma), за стандартних умов (16 год освітлення, 22 °C), за винятком експериментів з гіпокотилем та ростом коренів, в яких розсаду вирощували на вертикальних чашках за постійного освітлення та 22 °C. Для експериментів з нітратами рослини вирощували на модифікованому середовищі MS (середовище для рослин bioWORLD), доповненому достатньою кількістю нітратів (0 або 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинату, 1% сахарози та 1% А-агару (Sigma) за умов довгого дня.
кДНК GID1a, вставлену в pDONR221, рекомбінували з pDONR P4-P1R-pUBQ10 та pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW для отримання pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, вставлену в pDONR221, рекомбінували в pB7RWG266 для отримання p35S:IDD2-RFP. Для генерації pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент розміром 3,9 кб вище за течією від кодуючої області GID1b та фрагмент розміром 4,7 кб, що містить кДНК GID1b (1,3 кб) та термінатор (3,4 кб), спочатку ампліфікували за допомогою праймерів, наведених у Додатковій таблиці 3, а потім вставляли в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) та pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) відповідно, і, нарешті, рекомбінували з pDONR221 2xmTQ268 у цільовий вектор pGreen 012567 за допомогою клонування Gateway. Для створення pCUC2::LSSmOrange, послідовність промотора CUC2 (3229 пар основ вище за течією від ATG), а потім кодуюча послідовність великого mOrange зі зсувом Стокса (LSSmOrange)69 з сигналом ядерної локалізації N7 та транскрипційним термінатором NOS були зібрані у вектор-напрямок канаміцину pGreen за допомогою системи рекомбінації 3-фрагментів Gateway (Invitrogen). Бінарний вектор рослини був введений у штам Agrobacterium tumefaciens GV3101 та введений у листя Nicotiana benthamiana методом інфільтрації Agrobacterium та в Arabidopsis thaliana Col-0 методом занурення у флору відповідно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry та pCLV3::mCherry-NLS qmRGA були виділені з потомства F3 та F1 відповідних схрещувань відповідно.
Гібридизацію РНК in situ проводили на кінчиках пагонів довжиною приблизно 1 см72, які збирали та негайно фіксували у розчині FAA (3,7% формальдегіду, 5% оцтової кислоти, 50% етанолу), попередньо охолодженому до 4 °C. Після 2 × 15-хвилинної вакуумної обробки фіксатор змінювали, а зразки інкубували протягом ночі. кДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 та RGL3 та антисенсові зонди до їхніх 3'-UTR синтезували з використанням праймерів, наведених у Додатковій таблиці 3, як описано Rosier et al.73. Мічені дигоксигеніном зонди імунодетектували за допомогою антитіл до дигоксигеніну (3000-кратне розведення; Roche, номер у каталозі: 11 093 274 910), а зрізи забарвлювали розчином 5-бром-4-хлор-3-індолілфосфату (BCIP, 250-кратне розведення)/нітросинього тетразолію (NBT, 200-кратне розведення).
Час публікації: 10 лютого 2025 р.