Ріст апікальної меристеми пагона (SAM) є критичним для архітектури стебла. Рослинні гормонигібереліни(GA) відіграють ключову роль у координації росту рослин, але їх роль у SAM залишається недостатньо вивченою. Тут ми розробили раціометричний біосенсор передачі сигналів GA, сконструювавши білок DELLA для придушення його основної регуляторної функції в транскрипційній відповіді GA, зберігаючи при цьому його деградацію після розпізнавання GA. Ми демонструємо, що цей біосенсор, заснований на деградації, точно фіксує зміни в рівнях ГА та клітинних датчиках під час розробки. Ми використовували цей біосенсор для картографування сигнальної активності GA в SAM. Ми показуємо, що високі сигнали GA присутні переважно в клітинах, розташованих між зачатками органів, які є попередниками клітин міжвузлів. Використовуючи підходи посилення та втрати функції, ми додатково демонструємо, що GA регулює орієнтацію площини поділу клітини, встановлюючи канонічну клітинну організацію міжвузлів, тим самим сприяючи специфікації міжвузлів у SAM.
Верхівкова меристема пагона (SAM), розташована на верхівці пагона, містить нішу стовбурових клітин, активність яких генерує бічні органи та стовбурові вузли модульним та ітеративним способом протягом усього життя рослини. Кожна з цих повторюваних одиниць, або вузлів рослини, включає міжвузля та бічні органи у вузлах, а також пазушні меристеми в пазухах листків1. Ріст і організація вузлів рослин змінюється в процесі розвитку. У арабідопсису міжвузловий ріст пригнічується на вегетативній стадії, а пазушні меристеми залишаються в стані спокою в пазухах розеткових листків. Під час переходу до фази квітки SAM стає меристемою суцвіття, утворюючи подовжені міжвузля та пазушні бруньки, гілочки в пазухах стеблових листків, а пізніше безлисті квітки2. Хоча ми досягли значного прогресу в розумінні механізмів, які контролюють ініціацію листя, квітів і гілок, відносно мало відомо про те, як виникають міжвузля.
Розуміння просторово-часового розподілу ГА допоможе краще зрозуміти функції цих гормонів у різних тканинах і на різних стадіях розвитку. Візуалізація деградації злиття RGA-GFP, що експресується під дією власного промотора, надає важливу інформацію про регуляцію загального рівня GA в коренях15,16. Однак експресія RGA змінюється в різних тканинах17 і регулюється GA18. Таким чином, диференціальна експресія промотору RGA може призвести до картини флуоресценції, що спостерігається з RGA-GFP, і, таким чином, цей метод не є кількісним. Нещодавно біоактивний флуоресцеїн (Fl), мічений GA19,20, виявив накопичення GA в ендокортексі кореня та регуляцію його клітинних рівнів транспортом GA. Нещодавно датчик GA FRET nlsGPS1 показав, що рівні GA корелюють з подовженням клітин у коренях, нитках і темних гіпокотилях21. Однак, як ми бачили, концентрація GA не є єдиним параметром, що контролює активність передачі сигналів GA, оскільки вона залежить від складних процесів відчуття. Тут, спираючись на наше розуміння сигнальних шляхів DELLA та GA, ми повідомляємо про розробку та характеристику раціонометричного біосенсора на основі деградації для передачі сигналів GA. Щоб розробити цей кількісний біосенсор, ми використали мутантний GA-чутливий RGA, який був злитий з флуоресцентним білком і повсюдно експресувався в тканинах, а також GA-нечутливий флуоресцентний білок. Ми показуємо, що злиття мутантних білків RGA не заважає ендогенній передачі сигналів GA, коли вони повсюдно експресуються, і що цей біосенсор може кількісно визначати сигнальну активність, що є результатом як введення GA, так і обробки сигналу GA сенсорним апаратом з високою просторово-часовою роздільною здатністю. Ми використовували цей біосенсор, щоб скласти карту просторово-часового розподілу сигнальної активності GA та кількісно визначити, як GA регулює клітинну поведінку в епідермісі SAM. Ми демонструємо, що GA регулює орієнтацію площини поділу клітин SAM, розташованих між зачатками органів, тим самим визначаючи канонічну клітинну організацію міжвузля.
Нарешті, ми запитали, чи може qmRGA повідомляти про зміни ендогенних рівнів GA за допомогою зростаючих гіпокотилів. Раніше ми показали, що нітрат стимулює ріст шляхом збільшення синтезу GA і, у свою чергу, деградації DELLA34. Відповідно, ми помітили, що довжина гіпокотилю у розсади pUBQ10::qmRGA, вирощеної в умовах великої кількості нітратів (10 мМ NO3−), була значно довшою, ніж у розсади, вирощеної в умовах дефіциту нітратів (додаткова рис. 6а). Відповідно до відповіді на зростання, сигнали GA були вищими в гіпокотилях розсади, вирощеної в умовах 10 мМ NO3-, ніж у розсади, вирощеної за відсутності нітрату (додаткова рис. 6b, c). Таким чином, qmRGA також дозволяє відстежувати зміни в сигналізації GA, спричинені ендогенними змінами концентрації GA.
Щоб зрозуміти, чи залежить сигнальна активність GA, виявлена за допомогою qmRGA, від концентрації GA та сприйняття GA, як і очікувалося на основі конструкції датчика, ми проаналізували експресію трьох рецепторів GID1 у вегетативних і репродуктивних тканинах. У проростках репортерна лінія GID1-GUS показала, що GID1a і c були сильно експресовані в сім’ядолях (рис. 3a–c). Крім того, всі три рецептори були експресовані в листі, зачатках бічних коренів, кінчиках коренів (за винятком кореневої шапки GID1b) і судинній системі (рис. 3a–c). У SAM суцвіття ми виявили сигнали GUS лише для GID1b та 1c (додаткова рис. 7a–c). Гібридизація in situ підтвердила ці закономірності експресії та додатково продемонструвала, що GID1c рівномірно експресувався на низьких рівнях у SAM, тоді як GID1b демонстрував більш високу експресію на периферії SAM (додаткова фіг. 7d–l). Трансляційне злиття pGID1b::2xmTQ2-GID1b також виявило градуйований діапазон експресії GID1b, від низької експресії або її відсутності в центрі SAM до високої експресії на кордонах органів (додатковий рис. 7m). Таким чином, рецептори GID1 нерівномірно розподілені в тканинах і всередині них. У наступних експериментах ми також спостерігали, що надмірна експресія GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) підвищувала чутливість qmRGA в гіпокотилях до зовнішнього застосування GA (рис. 3d, e). Навпаки, флуоресценція, виміряна qd17mRGA в гіпокотилі, була нечутливою до обробки GA3 (рис. 3f, g). Для обох аналізів саджанці обробляли високими концентраціями GA (100 мкМ GA3), щоб оцінити швидку поведінку сенсора, де здатність зв’язуватися з рецептором GID1 була посилена або втрачена. Разом ці результати підтверджують, що біосенсор qmRGA виконує комбіновану функцію як датчик GA та GA, і припускають, що диференційована експресія рецептора GID1 може значно модулювати коефіцієнт випромінювання датчика.
На сьогоднішній день розподіл сигналів GA в SAM залишається неясним. Тому ми використовували рослини, що експресують qmRGA, і репортер стовбурових клітин pCLV3::mCherry-NLS35 для розрахунку кількісних карт високої роздільної здатності сигнальної активності GA, зосереджуючись на шарі L1 (епідерміс; рис. 4a, b, див. Методи та додаткові методи), оскільки L1 відіграє ключову роль у контролі росту SAM36. Тут експресія pCLV3::mCherry-NLS забезпечила фіксовану геометричну точку відліку для аналізу просторово-часового розподілу сигнальної активності GA37. Хоча GA вважається важливим для розвитку бічних органів4, ми спостерігали, що сигнали GA були низькими в квітковому зачатку (P), починаючи зі стадії P3 (рис. 4a, b), тоді як молоді зачатки P1 і P2 мали помірну активність, подібну до такої в центральній області (рис. 4a, b). Вищу активність сигналізації GA було виявлено на кордонах зачатків органу, починаючи з P1/P2 (з боків межі) і досягаючи піку на P4, а також у всіх клітинах периферійної області, розташованої між зачатками (рис. 4a, b і додаткова рис. 8a, b). Ця вища сигнальна активність GA спостерігалася не тільки в епідермісі, але також у шарах L2 і верхньому L3 (додаткова рис. 8b). Шаблон сигналів GA, виявлених у SAM за допомогою qmRGA, також залишався незмінним з часом (додатковий рис. 8c–f, k). Незважаючи на те, що конструкція qd17mRGA систематично знижувалася в SAM рослин T3 з п’яти незалежних ліній, які ми детально охарактеризували, ми змогли проаналізувати патерни флуоресценції, отримані за допомогою конструкції pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (додатковий рис. 8g–j, l). У цій контрольній лінії в SAM були виявлені лише незначні зміни у коефіцієнті флуоресценції, але в центрі SAM ми спостерігали чітке та несподіване зниження VENUS, пов’язаного з TagBFP. Це підтверджує, що сигнальний патерн, який спостерігається за допомогою qmRGA, відображає GA-залежну деградацію mRGA-VENUS, але також демонструє, що qmRGA може переоцінювати сигнальну активність GA в центрі меристеми. Підводячи підсумок, наші результати виявляють паттерн сигналізації GA, який в основному відображає розподіл зачатків. Такий розподіл інтерпримордіальної області (IPR) зумовлений поступовим встановленням високої сигнальної активності GA між примордієм, що розвивається, і центральною областю, тоді як у той же час сигнальна активність GA в примордіумі знижується (рис. 4c, d).
Розподіл рецепторів GID1b і GID1c (див. вище) свідчить про те, що диференціальна експресія рецепторів GA допомагає формувати структуру сигнальної активності GA в SAM. Нам було цікаво, чи може бути залучено диференціальне накопичення GA. Щоб дослідити цю можливість, ми використали датчик nlsGPS1 GA FRET21. Підвищена частота активації була виявлена в SAM nlsGPS1, обробленого 10 мкМ GA4+7 протягом 100 хв (додатковий рис. 9a–e), що вказує на те, що nlsGPS1 реагує на зміни концентрації GA в SAM, як це відбувається в коренях21. Просторовий розподіл частоти активації nlsGPS1 виявив відносно низькі рівні GA у зовнішніх шарах SAM, але показав, що вони були підвищені в центрі та на кордонах SAM (рис. 4e та додатковий рис. 9a, c). Це свідчить про те, що GA також розподіляється в SAM з просторовою структурою, порівнянною з тією, яку виявляє qmRGA. Як додатковий підхід ми також обробляли SAM з флуоресцентним GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) або окремо Fl як негативний контроль. Сигнал Fl був розподілений по всьому SAM, включаючи центральну область і зачаток, хоча і з меншою інтенсивністю (рис. 4j і додатковий рис. 10d). Навпаки, усі три GA-Fl накопичувалися саме в межах примордіуму та різною мірою в решті IPR, причому GA7-Fl накопичувався в найбільшому домені в IPR (рис. 4k і додаткова рис. 10a, b). Кількісне визначення інтенсивності флуоресценції показало, що співвідношення інтенсивності IPR до не-IPR було вищим у SAM, обробленому GA-Fl, порівняно з SAM, обробленим Fl (рис. 4l і додатковий рис. 10c). Разом ці результати свідчать про те, що GA присутній у більш високих концентраціях у клітинах IPR, які розташовані найближче до кордону органу. Це свідчить про те, що структура сигнальної активності SAM GA є результатом як диференціальної експресії рецепторів GA, так і диференціального накопичення GA в клітинах IPR поблизу кордонів органів. Таким чином, наш аналіз виявив несподіваний просторово-часовий патерн сигналізації GA з нижчою активністю в центрі та примордіумі SAM і більшою активністю в IPR у периферійній області.
Щоб зрозуміти роль диференціальної сигнальної активності GA в SAM, ми проаналізували кореляцію між сигнальною активністю GA, клітинним розширенням і поділом клітин, використовуючи сповільнене зображення SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS у реальному часі. Враховуючи роль ГА в регуляції росту, очікувалася позитивна кореляція з параметрами клітинного розширення. Тому ми спочатку порівняли карти сигнальної активності GA з картами швидкості росту клітинної поверхні (як проксі сили клітинного розширення для даної клітини та дочірніх клітин при поділі) та з картами анізотропії росту, яка вимірює спрямованість клітинного розширення (також використовується тут для даної клітини та для дочірніх клітин при поділі; рис. 5a, b, див. Методи та додаткові методи). Наші карти швидкості росту клітинної поверхні SAM узгоджуються з попередніми спостереженнями38,39, з мінімальними темпами росту на кордоні та максимальними темпами росту квітів, що розвиваються (рис. 5а). Аналіз основних компонентів (PCA) показав, що сигнальна активність GA негативно корелює з інтенсивністю росту клітинної поверхні (рис. 5c). Ми також показали, що основні осі варіацій, включаючи введення сигналу GA та інтенсивність росту, були ортогональними до напрямку, визначеного високою експресією CLV3, підтверджуючи виключення клітин з центру SAM в інших аналізах. Кореляційний аналіз Спірмена підтвердив результати PCA (рис. 5d), вказуючи на те, що вищі сигнали GA в IPR не призвели до більшого розширення клітин. Проте кореляційний аналіз виявив невелику позитивну кореляцію між активністю передачі сигналів GA та анізотропією росту (рис. 5c, d), що свідчить про те, що більш висока передача сигналів GA в IPR впливає на напрямок росту клітин і, можливо, на положення площини поділу клітини.
a, b Теплові карти середнього росту поверхні (a) та анізотропії росту (b) у SAM, усереднені по семи незалежним рослинам (використовуються як проксі для сили та напрямку розширення клітин відповідно). c Аналіз PCA включав такі змінні: сигнал GA, інтенсивність росту поверхні, анізотропію росту поверхні та експресію CLV3. Компонент PCA 1 в основному негативно корелював з інтенсивністю росту поверхні та позитивно корелював із сигналом GA. Компонент PCA 2 в основному позитивно корелював з анізотропією росту поверхні та негативно корелював з експресією CLV3. Відсотки представляють варіацію, пояснену кожним компонентом. d Кореляційний аналіз Спірмена між сигналом GA, інтенсивністю росту поверхні та анізотропією росту поверхні в масштабі тканини, за винятком CZ. Число праворуч — це значення ро Спірмена між двома змінними. Зірочки позначають випадки, коли кореляція/негативна кореляція є дуже значущою. e 3D-візуалізація клітин Col-0 SAM L1 за допомогою конфокальної мікроскопії. Нові клітинні стінки, утворені в SAM (але не примордіум) через 10 годин, забарвлюються відповідно до їх значень кута. Кольорова панель відображається в нижньому правому куті. На вставці показано відповідне 3D-зображення на 0 год. Експеримент повторювався двічі з однаковими результатами. f Коробкові графіки відображають швидкість поділу клітин у IPR та без IPR Col-0 SAM (n = 10 незалежних рослин). Центральна лінія показує медіану, а рамки рамки вказують на 25-й і 75-й процентилі. Вуса вказують на мінімальне та максимальне значення, визначені за допомогою програмного забезпечення R. Значення P були отримані за допомогою двостороннього t-критерію Велча. g, h Схематична діаграма, що показує (g) як виміряти кут нової клітинної стінки (пурпуровий) відносно радіального напрямку від центру SAM (біла пунктирна лінія) (враховуються лише значення гострого кута, тобто 0–90°), і (h) окружний/бічний та радіальний напрямки всередині меристеми. i Частотні гістограми орієнтації площини поділу клітини через SAM (темно-синій), IPR (середньо-синій) і не-IPR (світло-блакитний) відповідно. Значення P були отримані двостороннім тестом Колмогорова-Смирнова. Експеримент повторювався двічі з однаковими результатами. j Частотні гістограми орієнтації площини поділу клітини IPR навколо P3 (світло-зелений), P4 (середньо-зелений) і P5 (темно-зелений), відповідно. Значення P були отримані двостороннім тестом Колмогорова-Смирнова. Експеримент повторювався двічі з однаковими результатами.
Тому ми далі досліджували кореляцію між передачею сигналів GA та активністю поділу клітин шляхом ідентифікації новоутворених клітинних стінок під час аналізу (рис. 5e). Такий підхід дозволив виміряти частоту та напрямок поділу клітин. Дивно, але ми виявили, що частота поділу клітин в IPR та решті SAM (не-IPR, рис. 5f) була подібною, що вказує на те, що відмінності в передачі сигналів GA між IPR і не-IPR клітинами істотно не впливають на поділ клітин. Це та позитивна кореляція між передачею сигналів GA та анізотропією росту спонукали нас розглянути, чи може активність сигналізації GA впливати на орієнтацію площини поділу клітини. Ми виміряли орієнтацію нової клітинної стінки як гострий кут відносно радіальної осі, що з’єднує центр меристеми та центр нової клітинної стінки (рис. 5e-i), і спостерігали чітку тенденцію клітин до поділу під кутами, близькими до 90° відносно радіальної осі, з найвищими частотами, що спостерігалися при 70–80° (23,28%) та 80–90°. (22,62%) (рис. 5e,i), що відповідає поділам клітин в окружному/поперечному напрямку (рис. 5h). Щоб дослідити внесок передачі сигналів GA в цю поведінку клітинного поділу, ми проаналізували параметри клітинного поділу в IPR і non-IPR окремо (рис. 5i). Ми помітили, що розподіл кутів поділу в клітинах IPR відрізняється від такого в клітинах без IPR або в клітинах у всьому SAM, при цьому клітини IPR демонструють більшу частку бічних/кругових клітинних поділів, тобто 70–80° і 80–90° (33,86% і 30,71%, відповідно, відповідні пропорції) (рис. 5i). Таким чином, наші спостереження виявили зв'язок між високою передачею сигналів GA та орієнтацією площини поділу клітини, близькою до окружного напрямку, подібно до кореляції між активністю сигналізації GA та анізотропією росту (рис. 5c, d). Для подальшого встановлення просторового збереження цієї асоціації ми виміряли орієнтацію площини поділу в клітинах IPR, що оточують зачаток, починаючи з P3, оскільки найвища активність сигналізації GA була виявлена в цій області, починаючи з P4 (рис. 4). Кути поділу IPR навколо P3 і P4 не показали статистично значущих відмінностей, хоча в IPR навколо P4 спостерігалася підвищена частота бічних поділів клітин (рис. 5j). Однак у клітинах IPR навколо P5 різниця в орієнтації площини поділу клітини стала статистично значущою з різким збільшенням частоти поперечних поділів клітин (рис. 5j). Разом ці результати свідчать про те, що передача сигналів GA може контролювати орієнтацію клітинних поділів у SAM, що узгоджується з попередніми повідомленнями 40,41 про те, що висока передача сигналів GA може індукувати бічну орієнтацію клітинних поділів у IPR.
Передбачається, що клітини в IPR не будуть включені в зачатки, а скоріше в міжвузля 2,42,43. Поперечна орієнтація клітинних поділів в IPR може призвести до типової організації паралельних поздовжніх рядів епідермальних клітин у міжвузлях. Наші спостереження, описані вище, свідчать про те, що сигналізація GA, ймовірно, відіграє певну роль у цьому процесі, регулюючи напрямок поділу клітин.
Втрата функції кількох генів DELLA призводить до конститутивної відповіді GA, і мутанти della можна використовувати для перевірки цієї гіпотези44. Спочатку ми проаналізували моделі експресії п'яти генів DELLA в SAM. Транскрипційне злиття лінії GUS45 показало, що GAI, RGA, RGL1 і RGL2 (набагато меншою мірою) експресуються в SAM (додаткова фіг. 11a–d). Гібридизація in situ додатково продемонструвала, що мРНК GAI накопичується спеціально в зачатках і квітках, що розвиваються (додаткова рис. 11e). МРНК RGL1 і RGL3 були виявлені по всьому пологу SAM і в старих квітах, тоді як мРНК RGL2 була більш поширеною в прикордонній області (додатковий рис. 11f-h). Конфокальна візуалізація pRGL3::RGL3-GFP SAM підтвердила експресію, що спостерігається за допомогою гібридизації in situ, і показала, що білок RGL3 накопичується в центральній частині SAM (додатковий рис. 11i). Використовуючи лінію pRGA::GFP-RGA, ми також виявили, що білок RGA накопичується в SAM, але його кількість зменшується на кордоні, починаючи з P4 (додатковий рис. 11j). Примітно, що моделі експресії RGL3 і RGA узгоджуються з вищою сигнальною активністю GA в IPR, як виявлено qmRGA (рис. 4). Крім того, ці дані вказують на те, що всі DELLA виражаються в SAM і що їхнє вираження спільно охоплює весь SAM.
Далі ми проаналізували параметри поділу клітин у SAM дикого типу (Ler, контроль) і gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глобальних) мутантів (рис. 6a, b). Цікаво, що ми спостерігали статистично значущий зсув у розподілі частот кутів поділу клітин у SAM делла глобального мутанта порівняно з диким типом (рис. 6c). Ця зміна у мутанта della global була зумовлена збільшенням частоти кутів 80–90° (34,71% проти 24,55%) і, меншою мірою, кутів 70–80° (23,78% проти 20,18%), тобто відповідних поперечним поділам клітин (рис. 6c). Частота непоперечних поділів (0–60°) також була нижчою у мутанта della global (рис. 6c). Частота поперечних поділів клітин була значно збільшена в SAM мутанта della global (рис. 6b). Частота поперечних клітинних поділів у IPR також була вищою у мутанта della global порівняно з диким типом (рис. 6d). За межами області IPR дикий тип мав більш рівномірний розподіл кутів поділу клітин, тоді як мутант della global віддавав перевагу тангенціальним поділам, таким як IPR (рис. 6e). Ми також кількісно визначили орієнтацію клітинних поділів у SAM п’ятикратних мутантів ga2-оксидази (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 і ga2ox6-2), GA-неактивного мутантного фону, в якому накопичується GA. У відповідності зі збільшенням рівнів GA, SAM п’ятикратного ga2ox мутантного суцвіття був більшим, ніж у Col-0 (додатковий рис. 12a, b), і порівняно з Col-0, п’ятикратний ga2ox SAM показав чітко інший розподіл кутів поділу клітин, із збільшенням кутової частоти від 50° до 90°, тобто знову на користь тангенціальні поділки (додатковий рис. 12a–c). Таким чином, ми показуємо, що конститутивна активація передачі сигналів GA та накопичення GA індукують бічні поділи клітин у IPR та решті SAM.
a, b 3D-візуалізація шару L1 пофарбованого PI Ler (a) і глобального мутанта della (b) SAM за допомогою конфокальної мікроскопії. Нові клітинні стінки, утворені в SAM (але не зачаток) протягом 10-годинного періоду, показані та пофарбовані відповідно до їх значень кута. На вставці показано SAM о 0 год. У нижньому правому куті відображається кольорова панель. Стрілка в (b) вказує на приклад вирівняних файлів клітинок у глобальному делла-мутанті. Експеримент повторювався двічі з однаковими результатами. це порівняння частотного розподілу орієнтації площини поділу клітини в цілому SAM (d), IPR (e) і не-IPR (f) між Ler і global della. Значення P були отримані за допомогою двобічного тесту Колмогорова-Смирнова. f, g 3D-візуалізація конфокальних зображень PI-фарбованих SAM трансгенних рослин Col-0 (i) і pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панелі (a, b) показують нові клітинні стінки (але не зачатки), утворені в SAM протягом 10 годин. Експеримент повторювався двічі з однаковими результатами. h–j Порівняння частотного розподілу орієнтацій площини поділу клітин, розташованих у всьому SAM (h), IPR (i) і не-IPR (j) між рослинами Col-0 і pCUC2::gai-1-VENUS. Значення P були отримані за допомогою двобічного тесту Колмогорова–Смирнова.
Далі ми перевірили ефект інгібування сигналізації GA саме в IPR. З цією метою ми використовували промотор сім’ядольної чашки 2 (CUC2) для стимулювання експресії домінантного негативного білка gai-1, злитого з VENUS (у лінії pCUC2::gai-1-VENUS). У SAM дикого типу промотор CUC2 керує експресією більшості IPR в SAM, включаючи прикордонні клітини, починаючи з P4 і далі, і подібна специфічна експресія спостерігалася в рослинах pCUC2::gai-1-VENUS (див. нижче). Розподіл кутів поділу клітин у SAM або IPR рослин pCUC2::gai-1-VENUS істотно не відрізнявся від такого у дикого типу, хоча несподівано ми виявили, що клітини без IPR у цих рослинах діляться з більшою частотою 80–90° (рис. 6f–j).
Було висловлено припущення, що напрямок поділу клітин залежить від геометрії SAM, зокрема від напруги розтягування, спричиненої кривизною тканини46. Тому ми запитали, чи була змінена форма SAM у мутанта della global і рослин pCUC2::gai-1-VENUS. Як повідомлялося раніше12, розмір мутантного SAM della global був більшим, ніж у дикого типу (додатковий рис. 13a, b, d). Гібридизація in situ CLV3 і STM РНК підтвердила розширення меристем у мутантів della і додатково показала латеральне розширення ніші стовбурової клітини (додатковий рис. 13e, f, h, i). Однак кривизна SAM була подібною в обох генотипах (додатковий рис. 13k, m, n, p). Ми спостерігали подібне збільшення розміру у чотириразового мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без зміни кривизни порівняно з диким типом (додатковий рис. 13c, d, g, j, l, o, p). Частота орієнтації поділу клітини також вплинула на четверний мутант делла, але в меншій мірі, ніж у монолітний мутант делла (додатковий рис. 12d–f). Цей ефект дозування разом із відсутністю впливу на кривизну свідчить про те, що залишкова активність RGL3 у чотирикратному мутанті Della обмежує зміни в орієнтації клітинного поділу, спричинені втратою активності DELLA, і що зміни в бічних клітинних поділах відбуваються у відповідь на зміни в сигнальній активності GA, а не на зміни в геометрії SAM. Як описано вище, промотор CUC2 керує експресією IPR в SAM, починаючи з P4 (додатковий рис. 14a, b), і, навпаки, pCUC2::gai-1-VENUS SAM мав зменшений розмір, але вищу кривизну (додатковий рис. 14c–h). Ця зміна в морфології pCUC2::gai-1-VENUS SAM може призвести до іншого розподілу механічних напруг порівняно з диким типом, у якому високі окружні напруги починаються на меншій відстані від центру SAM47. Альтернативно, зміни в морфології pCUC2::gai-1-VENUS SAM можуть бути наслідком змін регіональних механічних властивостей, викликаних експресією трансгену48. В обох випадках це може частково компенсувати наслідки змін у передачі сигналів GA шляхом збільшення ймовірності того, що клітини будуть ділитися в окружній/поперечній орієнтації, пояснюючи наші спостереження.
Взяті разом, наші дані підтверджують, що вища сигналізація GA відіграє активну роль у бічній орієнтації площини поділу клітини в IPR. Вони також показують, що кривизна меристеми також впливає на орієнтацію площини поділу клітини в IPR.
Поперечна орієнтація площини поділу в IPR через високу сигнальну активність GA свідчить про те, що GA попередньо організовує файл радіальних клітин в епідермісі в межах SAM, щоб визначити клітинну організацію, яка пізніше буде знайдена в епідермальному міжвузлі. Дійсно, такі клітинні файли часто були помітні на зображеннях SAM мутантів della global (рис. 6b). Таким чином, для подальшого вивчення функції розвитку просторової моделі сигналізації GA в SAM ми використовували сповільнену візуалізацію для аналізу просторової організації клітин в IPR у дикого типу (Ler і Col-0), глобальних мутантів della та трансгенних рослин pCUC2::gai-1-VENUS.
Ми виявили, що qmRGA показав, що сигнальна активність GA в IPR зросла з P1/P2 і досягла піку на P4, і ця картина залишалася постійною з часом (рис. 4a–f і додаткова рис. 8c–f, k). Щоб проаналізувати просторову організацію клітин в IPR зі збільшенням сигналу GA, ми позначили клітини Ler IPR вище та з боків від P4 відповідно до їхньої долі розвитку, проаналізованої через 34 години після першого спостереження, тобто більше двох пластидних разів, що дозволяє нам стежити за клітинами IPR під час розвитку зачатків від P1/P2 до P4. Ми використовували три різні кольори: жовтий для тих клітин, які були інтегровані в примордіум поблизу P4, зелений для тих, які були в IPR, і фіолетовий для тих, які брали участь в обох процесах (рис. 7a–c). У t0 (0 год) перед P4 було видно 1–2 шари клітин IPR (рис. 7а). Як і очікувалося, коли ці клітини ділилися, вони робили це в основному через поперечну площину поділу (рис. 7a–c). Подібні результати були отримані за допомогою Col-0 SAM (зосереджуючись на P3, межа якого згинається подібно до P4 у Ler), хоча в цьому генотипі складка, утворена на межі квітки, швидше приховала клітини IPR (рис. 7g–i). Таким чином, схема поділу клітин IPR попередньо організовує клітини в радіальні ряди, як у міжвузлях. Організація радіальних рядів і локалізація клітин IPR між послідовними органами припускають, що ці клітини є міжвузловими попередниками.
Тут ми розробили біосенсор передачі сигналів GA, qmRGA, який дозволяє кількісно відображати сигнальну активність GA в результаті комбінованих концентрацій GA та рецепторів GA, мінімізуючи втручання в ендогенні сигнальні шляхи, таким чином надаючи інформацію про функцію GA на клітинному рівні. З цією метою ми сконструювали модифікований білок DELLA, mRGA, який втратив здатність зв’язувати партнерів по взаємодії DELLA, але залишається чутливим до протеолізу, індукованого GA. qmRGA реагує як на екзогенні, так і на ендогенні зміни рівнів GA, і його властивості динамічного сприйняття дозволяють оцінити просторово-часові зміни в сигнальній активності GA під час розвитку. qmRGA також є дуже гнучким інструментом, оскільки його можна адаптувати до різних тканин шляхом зміни промотора, який використовується для його експресії (якщо необхідно), і, враховуючи збережену природу сигнального шляху GA та мотиву PFYRE серед покритонасінних рослин, його, ймовірно, можна буде перенести на інші види22. У відповідності з цим було також показано, що еквівалентна мутація в рисовому білку SLR1 DELLA (HYY497AAA) пригнічує активність репресора росту SLR1, водночас лише незначно зменшуючи його деградацію, опосередковану GA, подібно до mRGA23. Примітно, що нещодавні дослідження Arabidopsis показали, що одна амінокислотна мутація в домені PFYRE (S474L) змінила транскрипційну активність RGA, не впливаючи на його здатність взаємодіяти з партнерами по фактору транскрипції50. Хоча ця мутація дуже близька до 3 амінокислотних замін, присутніх у mRGA, наші дослідження показують, що ці дві мутації змінюють відмінні характеристики DELLA. Хоча більшість партнерів факторів транскрипції зв’язуються з доменами LHR1 і SAW DELLA26,51, деякі консервативні амінокислоти в домені PFYRE можуть допомогти стабілізувати ці взаємодії.
Розвиток міжвузлів є ключовою ознакою архітектури рослини та підвищення врожайності. qmRGA виявив вищу активність сигналізації GA в клітинах-попередниках міжвузлів IPR. Поєднуючи кількісну візуалізацію та генетику, ми показали, що сигнальні шаблони GA накладають кругові/поперечні площини поділу клітин в епідермісі SAM, формуючи організацію поділу клітин, необхідну для розвитку міжвузлів. Під час розробки було ідентифіковано декілька регуляторів орієнтації площини поділу клітини52,53. Наша робота є наочним прикладом того, як сигнальна активність GA регулює цей клітинний параметр. DELLA може взаємодіяти з білковими комплексами попереднього згортання41, тому передача сигналів GA може регулювати орієнтацію площини клітинного поділу, безпосередньо впливаючи на орієнтацію кортикальних мікротрубочок40,41,54,55. Ми несподівано показали, що в SAM корелятом вищої сигнальної активності GA було не подовження або поділ клітини, а лише анізотропія росту, що узгоджується з прямим впливом GA на напрямок поділу клітин в IPR. Однак ми не можемо виключити, що цей ефект також може бути непрямим, наприклад, опосередкованим GA-індукованим розм’якшенням клітинної стінки56. Зміни властивостей клітинної стінки викликають механічний стрес57,58, який також може впливати на орієнтацію площини поділу клітини, впливаючи на орієнтацію кортикальних мікротрубочок39,46,59. Комбіновані ефекти механічного стресу, викликаного GA, і прямого регулювання орієнтації мікротрубочок за допомогою GA можуть брати участь у створенні специфічної моделі орієнтації клітинного поділу в IPR для визначення міжвузлів, і для перевірки цієї ідеї необхідні подальші дослідження. Подібним чином попередні дослідження підкреслили важливість DELLA-взаємодіючих білків TCP14 і 15 у контролі формування міжвузлів60,61, і ці фактори можуть опосередковувати дію ГА разом з BREVIPEDICELLUS (BP) і PENNYWISE (PNY), які регулюють розвиток міжвузлів і, як було показано, впливають на передачу сигналів ГА2,62. Враховуючи, що DELLA взаємодіють із сигнальними шляхами брасиностероїдів, етилену, жасмонової кислоти та абсцизової кислоти (ABA) 63, 64 і що ці гормони можуть впливати на орієнтацію мікротрубочок 65, вплив ГА на орієнтацію клітинного поділу також може бути опосередковано іншими гормонами.
Ранні цитологічні дослідження показали, що як внутрішня, так і зовнішня області SAM Arabidopsis необхідні для розвитку міжвузлів2,42. Той факт, що GA активно регулює поділ клітин у внутрішніх тканинах12, підтверджує подвійну функцію GA у регулюванні меристеми та розміру міжвузлів у SAM. Модель спрямованого поділу клітин також жорстко регулюється у внутрішній тканині SAM, і ця регуляція є важливою для росту стебла52. Буде цікаво дослідити, чи GA також відіграє роль в орієнтації площини поділу клітини у внутрішній організації SAM, таким чином синхронізуючи специфікацію та розвиток міжвузлів у SAM.
Рослини вирощували in vitro в ґрунті або 1x середовищі Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) з додаванням 1% сахарози та 1% агару (Sigma) у стандартних умовах (16 годин світла, 22 °C), за винятком експериментів із ростом гіпокотилю та коренів, у яких розсаду вирощували на вертикальних пластинах при постійному освітленні та 22 °C. Для експериментів з нітратами рослини вирощували на модифікованому середовищі MS (рослинне середовище bioWORLD), доповненому адекватними нітратами (0 або 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинату, 1% сахарози та 1% А-агару (Sigma) в умовах тривалого дня.
КДНК GID1a, вставлену в pDONR221, рекомбінували з pDONR P4-P1R-pUBQ10 і pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW для створення pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, вставлена в pDONR221, була рекомбінована в pB7RWG266 для створення p35S:IDD2-RFP. Щоб генерувати pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент 3,9 kb перед кодуючою областю GID1b і фрагмент 4,7 kb, що містить кДНК GID1b (1,3 kb) і термінатор (3,4 kb), спочатку ампліфікували за допомогою праймерів у Додатковій таблиці 3, а потім вставили в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher). Scientific) і pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), відповідно, і, нарешті, рекомбінували з pDONR221 2xmTQ268 у цільовий вектор pGreen 012567 за допомогою клонування Gateway. Для генерації pCUC2::LSSmOrange послідовність промотора CUC2 (3229 п.н. перед ATG), за якою слідує кодуюча послідовність великого mOrange зі зміщенням Стокса (LSSmOrange)69 із сигналом ядерної локалізації N7 і термінатором транскрипції NOS, були зібрані у вектор націлювання канаміцину pGreen за допомогою 3-фрагментної рекомбінаційної системи Gateway (Інвітроген). Рослинний бінарний вектор був введений у штам Agrobacterium tumefaciens GV3101 і введений у листя Nicotiana benthamiana методом інфільтрації Agrobacterium і в Arabidopsis thaliana Col-0 методом квіткового занурення відповідно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry та pCLV3::mCherry-NLS qmRGA були виділені з нащадків F3 та F1 відповідних схрещувань відповідно.
Гібридизацію РНК in situ проводили на кінчиках пагонів довжиною приблизно 1 см72, які збирали та негайно фіксували в розчині FAA (3,7% формальдегіду, 5% оцтової кислоти, 50% етанолу), попередньо охолодженому до 4 °C. Після 2 × 15-хвилинних вакуумних обробок фіксатор змінювали та зразки інкубували протягом ночі. КДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 і RGL3 і антисмислові зонди до їх 3'-UTR були синтезовані з використанням праймерів, наведених у Додатковій таблиці 3, як описано Rosier et al.73. Зонди, мічені дигоксигенином, імунно виявляли за допомогою антитіл до дигоксигеніну (3000-кратне розведення; Roche, номер за каталогом: 11 093 274 910), а зрізи фарбували 5-бром-4-хлор-3-індолілфосфатом (BCIP, 250-кратне розведення)/нітросинім тетразолієм (NBT, 200-кратне розведення).
Час публікації: 10 лютого 2025 р