Регулятори росту рослин використовувалися як стратегія зменшення теплового стресу в різних культурах

Виробництво рису скорочується через зміну клімату та мінливість у Колумбії.Регулятори росту рослинбули використані як стратегія зменшення теплового стресу в різних культурах. Таким чином, мета цього дослідження полягала в оцінці фізіологічних ефектів (продихової провідності, продихової провідності, загального вмісту хлорофілу, співвідношення Fv/Fm двох комерційних генотипів рису, які піддалися комбінованому тепловому стресу (високі денні та нічні температури), температура навісу та відносний вміст води) та біохімічних змінних (вміст малонового диальдегіду (MDA) та пролінової кислоти). Перший і другий досліди проводили з використанням рослин двох генотипів рису Federrose 67 («F67») і Federrose 2000 («F2000») відповідно. Обидва експерименти аналізували разом як серію експериментів. Встановлені методи обробки були такими: абсолютний контроль (AC) (рослини рису, вирощені при оптимальних температурах (денна/нічна температура 30/25 °C)), контроль теплового стресу (SC) [рослини рису, які піддавалися лише комбінованому тепловому стресу (40/25 °C). 30°C)], а рослини рису піддавали стресу та обприскували регуляторами росту рослин (стрес+AUX, стрес+BR, стрес+CK або стрес+GA) двічі (за 5 днів до та 5 днів після теплового стресу). Обприскування SA підвищило загальний вміст хлорофілу в обох сортах (свіжа маса рослин рису «F67″ і «F2000» становила 3,25 і 3,65 мг/г відповідно) порівняно з рослинами SC (свіжа маса рослин «F67» становила 2,36 і 2,56 мг). г-1)» і рису «F2000», позакореневе застосування CK також загалом покращило продихову провідність рослин рису «F2000» (499,25 проти 150,60 ммоль м-2 с) порівняно з контролем теплового стресу. теплового стресу температура крони рослини знижується на 2–3 °С, зменшується вміст МДА в рослинах. Індекс відносної толерантності показує, що позакореневе підживлення CK (97,69%) і BR (60,73%) може допомогти полегшити проблему комбінованого тепла. стрес в основному в рослинах рису F2000. На закінчення, позакореневе обприскування BR або CK можна розглядати як агрономічну стратегію, яка допомагає зменшити негативний вплив комбінованих умов теплового стресу на фізіологічну поведінку рослин рису.
Рис (Oryza sativa) належить до родини Poaceae і є одним із найбільш культивованих злаків у світі разом із кукурудзою та пшеницею (Bajaj and Mohanty, 2005). Площа посіву рису становить 617 934 га, а національне виробництво у 2020 році становило 2 937 840 тонн із середньою врожайністю 5,02 тонн/га (Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021).
Глобальне потепління впливає на посіви рису, що призводить до різних типів абіотичних стресів, таких як високі температури та періоди посухи. Зміна клімату спричиняє підвищення глобальної температури; Прогнозується підвищення температури на 1,0–3,7°C у 21 столітті, що може збільшити частоту та інтенсивність теплового стресу. Підвищення температури навколишнього середовища вплинуло на рис, спричинивши зниження врожайності на 6–7%. З іншого боку, зміна клімату також призводить до несприятливих екологічних умов для сільськогосподарських культур, таких як періоди сильної посухи або високі температури в тропічних і субтропічних регіонах. Крім того, явища мінливості, такі як Ель-Ніньо, можуть призвести до теплового стресу та посилити пошкодження врожаю в деяких тропічних регіонах. У Колумбії очікується, що до 2050 року температура в районах, де вирощують рис, зросте на 2–2,5 °C, що призведе до скорочення виробництва рису та впливу на потік продукції на ринки та в ланцюги поставок.
Більшість рисових культур вирощують у районах, де температури близькі до оптимального діапазону для росту культур (Shah et al., 2011). Повідомляється, що оптимальні середні денні та нічні температури дляріст і розвиток рисузазвичай становлять 28°C і 22°C відповідно (Kilasi та ін., 2018; Calderón-Páez та ін., 2021). Температури вище цих порогів можуть спричинити періоди помірного та сильного теплового стресу під час чутливих стадій розвитку рису (кущіння, цвітіння, цвітіння та наливання зерна), таким чином негативно впливаючи на врожайність зерна. Це зниження врожайності в основному пов’язане з тривалими періодами теплового стресу, що впливає на фізіологію рослин. Через взаємодію різних факторів, таких як тривалість стресу та досягнута максимальна температура, тепловий стрес може спричинити низку незворотних пошкоджень метаболізму та розвитку рослин.
Тепловий стрес впливає на різні фізіологічні та біохімічні процеси в рослинах. Фотосинтез листя є одним із процесів, найбільш чутливих до теплового стресу в рослинах рису, оскільки швидкість фотосинтезу знижується на 50%, коли денна температура перевищує 35°C. Фізіологічні реакції рослин рису відрізняються залежно від типу теплового стресу. Наприклад, швидкість фотосинтезу та продихова провідність пригнічуються, коли рослини піддаються дії високих денних температур (33–40 °C) або високих денних і нічних температур (35–40 °C вдень, 28–30 °C). C означає ніч) (Lü et al., 2013; Fahad et al., 2016; Chaturvedi et al., 2017). Високі нічні температури (30°C) викликають помірне пригнічення фотосинтезу, але посилюють нічне дихання (Fahad et al., 2016; Alvarado-Sanabria et al., 2017). Незалежно від періоду стресу, тепловий стрес також впливає на вміст хлорофілу в листі, співвідношення змінної флуоресценції хлорофілу до максимальної флуоресценції хлорофілу (Fv/Fm) і активацію Рубіско в рослинах рису (Cao та ін. 2009; Інь та ін. 2010). ) Санчес Рейносо та ін., 2014).
Біохімічні зміни є ще одним аспектом адаптації рослин до теплового стресу (Wahid et al., 2007). Вміст проліну використовувався як біохімічний індикатор стресу рослин (Ahmed and Hassan 2011). Пролін відіграє важливу роль у метаболізмі рослин, оскільки він діє як джерело вуглецю або азоту та як стабілізатор мембрани в умовах високої температури (Sánchez-Reinoso та ін., 2014). Високі температури також впливають на стабільність мембран через перекисне окислення ліпідів, що призводить до утворення малонового діальдегіду (MDA) (Wahid et al., 2007). Таким чином, вміст MDA також використовувався для розуміння структурної цілісності клітинних мембран під впливом теплового стресу (Cao et al., 2009; Chavez-Arias et al., 2018). Нарешті, комбінований тепловий стрес [37/30°C (день/ніч)] збільшив відсоток витоку електроліту та вміст малонового діальдегіду в рисі (Liu et al., 2013).
Використання регуляторів росту рослин (GR) було оцінено для пом’якшення негативних наслідків теплового стресу, оскільки ці речовини беруть активну участь у відповідях рослин або механізмах фізіологічного захисту від такого стресу (Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. et al., 2011; Ahmed et al., 2015). Екзогенне застосування генетичних ресурсів позитивно вплинуло на стійкість різних культур до теплового стресу. Дослідження показали, що такі фітогормони, як гібереліни (GA), цитокініни (CK), ауксини (AUX) або брасиностероїди (BR), призводять до збільшення різноманітних фізіологічних і біохімічних змінних (Peleg і Blumwald, 2011; Yin та ін. Ren, 2011; Mitler та ін., 2012; Zhou та ін., 2014). У Колумбії екзогенне застосування генетичних ресурсів та його вплив на посіви рису не були повністю зрозумілі та вивчені. Однак попереднє дослідження показало, що позакореневе обприскування BR може покращити толерантність рису шляхом покращення характеристик газообміну, вмісту хлорофілу або проліну в листі проростків рису (Quintero-Calderón et al., 2021).
Цитокініни опосередковують реакцію рослин на абіотичні стреси, включаючи тепловий стрес (Ha et al., 2012). Крім того, повідомлялося, що екзогенне застосування CK може зменшити термічне пошкодження. Наприклад, екзогенне застосування зеатину збільшило швидкість фотосинтезу, вміст хлорофілу a і b і ефективність транспорту електронів у повзучої трави (Agrotis estolonifera) під час теплового стресу (Xu and Huang, 2009; Jespersen and Huang, 2015). Екзогенне застосування зеатину також може покращити антиоксидантну активність, посилити синтез різних білків, зменшити пошкодження активними формами кисню (АФК) і виробництво малонового діальдегіду (МДА) у рослинних тканинах (Чернядьєв, 2009; Янг та ін., 2009). , 2016; Кумар та ін., 2020).
Використання гіберелінової кислоти також показало позитивну реакцію на тепловий стрес. Дослідження показали, що біосинтез ГК опосередковує різні метаболічні шляхи та підвищує толерантність за умов високої температури (Алонсо-Рамірез та ін. 2009; Хан та ін. 2020). Абдель-Набі та ін. (2020) виявили, що позакореневе обприскування екзогенної ГК (25 або 50 мг*л) може підвищити швидкість фотосинтезу та антиоксидантну активність рослин апельсина, які страждають від теплового стресу, порівняно з контрольними рослинами. Було також помічено, що екзогенне застосування ГК збільшує відносний вміст вологи, вміст хлорофілу та каротиноїдів і зменшує перекисне окислення ліпідів у фініковій пальмі (Phoenix dactylifera) під впливом теплового стресу (Khan et al., 2020). Ауксин також відіграє важливу роль у регулюванні адаптивних реакцій росту на умови високої температури (Sun та ін., 2012; Wang та ін., 2016). Цей регулятор росту діє як біохімічний маркер у різних процесах, таких як синтез або деградація проліну в умовах абіотичного стресу (Ali et al. 2007). Крім того, AUX також посилює антиоксидантну активність, що призводить до зниження МДА в рослинах через зниження перекисного окислення ліпідів (Bielach et al., 2017). Сергєєв та ін. (2018) спостерігали, що в рослинах гороху (Pisum sativum) за теплового стресу підвищується вміст проліну – диметиламіноетоксикарбонілметил)нафтилхлорметилового ефіру (ТА-14). У тому ж експерименті вони також спостерігали нижчі рівні MDA в оброблених рослинах порівняно з рослинами, які не оброблені AUX.
Брасиностероїди — ще один клас регуляторів росту, які використовуються для пом’якшення наслідків теплового стресу. Огвено та ін. (2008) повідомили, що екзогенний спрей BR збільшив чисту швидкість фотосинтезу, продихову провідність і максимальну швидкість карбоксилування Rubisco рослин томатів (Solanum lycopersicum) за умов теплового стресу протягом 8 днів. Позакореневе обприскування епібрасиностероїдами може збільшити чисту швидкість фотосинтезу рослин огірка (Cucumis sativus) за умов теплового стресу (Yu et al., 2004). Крім того, екзогенне застосування BR затримує деградацію хлорофілу та підвищує ефективність використання води та максимальний квантовий вихід фотохімії ФСІІ в рослинах під впливом теплового стресу (Holá та ін., 2010; Toussagunpanit та ін., 2015).
Через зміну та мінливість клімату посіви рису стикаються з періодами високих денних температур (Lesk та ін., 2016; Garcés, 2020; Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021). У фенотипуванні рослин використання фітонутрієнтів або біостимуляторів вивчалося як стратегія пом’якшення теплового стресу в районах вирощування рису (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderón et al., 2021). Крім того, використання біохімічних і фізіологічних змінних (температура листя, провідність продихів, параметри флуоресценції хлорофілу, хлорофіл і відносний вміст води, малоновий діальдегід і синтез проліну) є надійним інструментом для скринінгу рослин рису в умовах теплового стресу на місцевому та міжнародному рівнях (Sánchez-Reynoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017; Дослідження використання позакореневого обприскування рису на місцевому рівні залишається рідкісним. Таким чином, дослідження фізіологічних і біохімічних реакцій застосування регуляторів росту має велике значення для розробки практичних стратегій усунення негативних наслідків періоду теплового стресу для рису (устьична провідність, параметри флуоресценції хлорофілу та відносний вміст води) та біохімічні ефекти позакореневого підживлення чотирьох регуляторів росту рослин (AUX, CK, GA та BR). (Фотосинтетичні пігменти, вміст малонового діальдегіду та проліну) Змінні у двох промислових генотипах рису, які зазнали комбінованого теплового стресу (високі денні та нічні температури).
У цьому дослідженні було проведено два незалежних експерименти. Вперше були використані генотипи Federrose 67 (F67: генотип, який розвивався при високих температурах протягом останнього десятиліття) і Federrose 2000 (F2000: генотип, розроблений в останнє десятиліття 20-го століття, що демонструє стійкість до вірусу білого листя). насіння. і другий експеримент відповідно. Обидва генотипи широко культивуються колумбійськими фермерами. Насіння висівали в лотки об’ємом 10 л (довжина 39,6 см, ширина 28,8 см, висота 16,8 см), що містили супіщаний ґрунт з 2% органічних речовин. П'ять попередньо пророщених насіння були висаджені в кожен лоток. Піддони були розміщені в теплиці факультету сільськогосподарських наук Національного університету Колумбії, кампус Боготи (43°50′56″ пн.ш., 74°04′051″ зх.д.), на висоті 2556 м над рівнем моря (н.р.м.). м.) і проводилися з жовтня по грудень 2019 року. Один експеримент (Federroz 67) і другий експеримент (Federroz 2000) в тому ж сезоні 2020 року.
Умови навколишнього середовища в теплиці протягом кожного сезону посадки такі: температура вдень і вночі 30/25°C, відносна вологість 60~80%, природний фотоперіод 12 годин (фотосинтетично активне випромінювання 1500 мкмоль (фотонів) м-2 с-). 1 опівдні). Рослини удобрювали відповідно до вмісту кожного елемента через 20 днів після появи насіння (DAE), відповідно до Sánchez-Reinoso та ін. (2019): 670 мг азоту на рослину, 110 мг фосфору на рослину, 350 мг калію на рослину, 68 мг кальцію на рослину, 20 мг магнію на рослину, 20 мг сірки на рослину, 17 мг кремнію на рослину. Рослини містять 10 мг бору на рослину, 17 мг міді на рослину та 44 мг цинку на рослину. Рослини рису підтримували на рівні до 47 DAE в кожному експерименті, коли вони досягали фенологічної стадії V5 протягом цього періоду. Попередні дослідження показали, що ця фенологічна стадія є відповідним часом для проведення досліджень теплового стресу в рисі (Sánchez-Reinoso та ін., 2014; Альварадо-Санабрія та ін., 2017).
У кожному досліді проводили дві окремі обробки регулятором росту листя. Перший набір позакореневого обприскування фітогормонами був застосований за 5 днів до обробки тепловим стресом (42 DAE), щоб підготувати рослини до екологічного стресу. Потім проводили друге позакореневе обприскування через 5 днів після того, як рослини зазнали стресових умов (52 DAE). Було використано чотири фітогормони, і властивості кожного активного інгредієнта, розпиленого в цьому дослідженні, наведено в додатковій таблиці 1. Використані концентрації регуляторів росту листя були такими: (i) ауксин (1-нафтилоцтова кислота: NAA) у концентрації 5 × 10–5 М (ii) 5 × 10–5 М гіберелін (гіберелінова кислота: NAA); GA3); (iii) Цитокінін (транс-зеатин) 1 × 10-5 M (iv) Брасіностероїди [спіростан-6-он, 3,5-дигідрокси-, (3b, 5a, 25R)] 5 × 10-5; М. Ці концентрації були вибрані тому, що вони викликають позитивні реакції та підвищують стійкість рослин до теплового стресу (Zahir et al., 2001; Wen et al., 2010; El-Bassiony et al., 2012; Salehifar et al., 2017). Рослини рису без будь-яких спреїв регуляторів росту рослин обробляли лише дистильованою водою. Усі рослини рису обприскували ручним розпилювачем. Нанесіть 20 мл H2O на рослину, щоб зволожити верхню та нижню поверхні листя. Усі позакореневі обприскування використовували сільськогосподарський ад’ювант (Agrotin, Bayer CropScience, Колумбія) у концентрації 0,1% (об’єм/об’єм). Відстань між горщиком і обприскувачем 30 см.
Обробку тепловим стресом проводили через 5 днів після першого позакореневого обприскування (47 DAE) у кожному експерименті. Рослини рису переносили з теплиці в камеру для вирощування на 294 л (MLR-351H, Sanyo, IL, США), щоб встановити тепловий стрес або підтримувати ті самі умови навколишнього середовища (47 DAE). Комбінована обробка тепловим стресом була проведена шляхом налаштування камери на наступні денні/нічні температури: денна висока температура [40 °C протягом 5 годин (з 11:00 до 16:00)] і нічний період [30 °C протягом 5 годин]. 8 днів поспіль (з 19:00 до 24:00). Температура стресу та час впливу були обрані на основі попередніх досліджень (Sánchez-Reynoso та ін. 2014; Альварадо-Санабрія та ін. 2017). З іншого боку, групу рослин, перенесених у камеру вирощування, зберігали в теплиці при тій же температурі (30°C вдень/25°C вночі) протягом 8 днів поспіль.
Наприкінці експерименту були отримані наступні групи обробки: (i) умови температури росту + застосування дистильованої води [Абсолютний контроль (AC)], (ii) умови теплового стресу + застосування дистильованої води [Контроль теплового стресу (SC)], (iii) умови умови теплового стресу + застосування ауксину (AUX), (iv) умови теплового стресу + застосування гібереліну (GA), (v) умови теплового стресу + застосування цитокініну (CK), та (vi) стан теплового стресу + брасиностероїд (BR) Додаток. Ці групи лікування використовували для двох генотипів (F67 і F2000). Усі обробки проводили в повністю випадковому плані з п’ятьма повторами, кожна з яких складалася з однієї рослини. Кожну рослину використовували для зчитування змінних, визначених наприкінці експерименту. Експеримент тривав 55 DAE.
Устьичну провідність (gs) вимірювали за допомогою портативного порозометра (SC-1, METER Group Inc., США) в діапазоні від 0 до 1000 ммоль м-2 с-1 з отвором камери для зразків 6,35 мм. Вимірювання проводять шляхом прикріплення зонда стомаметра до зрілого листка з повністю розкритим головним пагоном рослини. Для кожної обробки вимірювання gs брали на трьох листках кожної рослини між 11:00 і 16:00 і усереднювали.
RWC визначали згідно з методом, описаним Ghoulam et al. (2002). Повністю розгорнутий лист, використаний для визначення g, також використовувався для вимірювання RWC. Свіжу масу (FW) визначали відразу після збору врожаю за допомогою цифрових ваг. Потім листя поміщали в пластиковий контейнер, наповнений водою, і залишали в темряві при кімнатній температурі (22°C) на 48 годин. Потім зважте на цифрових вагах і запишіть розгорнуту вагу (TW). Набряклі листя сушили в печі при 75°C протягом 48 годин і реєстрували їх суху вагу (DW).
Відносний вміст хлорофілу визначали за допомогою хлорофілометра (atLeafmeter, FT Green LLC, США) і виражали в одиницях atLeaf (Dey et al., 2016). Показники максимальної квантової ефективності PSII (співвідношення Fv/Fm) реєстрували за допомогою флуориметра хлорофілу безперервного збудження (Handy PEA, Hansatech Instruments, Великобританія). Листя адаптували до темряви за допомогою листових затискачів протягом 20 хвилин перед вимірюванням Fv/Fm (Restrepo-Diaz і Garces-Varon, 2013). Після акліматизації листя до темряви виміряли базову лінію (F0) і максимальну флуоресценцію (Fm). З цих даних було розраховано змінну флуоресценцію (Fv = Fm – F0), відношення змінної флуоресценції до максимальної флуоресценції (Fv/Fm), максимальний квантовий вихід фотохімії PSII (Fv/F0) і співвідношення Fm/F0 (Baker, 2008; Lee et al., 2017). Відносні показники хлорофілу та флуоресценції хлорофілу брали на тих самих листках, які використовувалися для вимірювань gs.
Приблизно 800 мг свіжої ваги листя було зібрано як біохімічні змінні. Потім зразки листя гомогенізували в рідкому азоті та зберігали для подальшого аналізу. Спектрометричний метод, який використовується для оцінки вмісту хлорофілу a, b і каротиноїдів у тканинах, базується на методі та рівняннях, описаних Wellburn (1994). Зразки тканин листя (30 мг) збирали та гомогенізували в 3 мл 80% ацетону. Потім зразки центрифугували (модель 420101, Becton Dickinson Primary Care Diagnostics, США) при 5000 об/хв протягом 10 хвилин для видалення частинок. Супернатант розбавляли до кінцевого об’єму 6 мл шляхом додавання 80% ацетону (Sims and Gamon, 2002). Вміст хлорофілу визначали при 663 (хлорофіл а) і 646 (хлорофіл b) нм, а каротиноїдів при 470 нм за допомогою спектрофотометра (Spectronic BioMate 3 UV-vis, Thermo, США).
Метод тіобарбітурової кислоти (TBA), описаний Hodges et al. (1999) використовувався для оцінки мембранного перекисного окислення ліпідів (MDA). Приблизно 0,3 г тканини листя також гомогенізували в рідкому азоті. Зразки центрифугували при 5000 об/хв і абсорбцію вимірювали на спектрофотометрі при 440, 532 і 600 нм. Нарешті, концентрація MDA була розрахована з використанням коефіцієнта екстинкції (157 M мл-1).
Вміст проліну у всіх обробках визначали за допомогою методу, описаного Bates et al. (1973). До проби, що зберігається, додають 10 мл 3 % водного розчину сульфосаліцилової кислоти і фільтрують через фільтрувальний папір ватман (№ 2). Потім 2 мл цього фільтрату вводили в реакцію з 2 мл нініводневої кислоти та 2 мл крижаної оцтової кислоти. Суміш поміщали на водяну баню при 90°С на 1 годину. Зупиніть реакцію, інкубуючи на льоду. Енергійно струсіть пробірку вихровим шейкером і розчиніть отриманий розчин у 4 мл толуолу. Показники абсорбції визначали при 520 нм за допомогою того самого спектрофотометра, який використовується для кількісного визначення фотосинтетичних пігментів (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Медісон, Вісконсин, США).
Метод, описаний Gerhards et al. (2016) для розрахунку температури навісу та CSI. Термічні фотографії були зроблені камерою FLIR 2 (FLIR Systems Inc., Бостон, Массачусетс, США) з точністю ±2°C наприкінці періоду стресу. Помістіть білу поверхню позаду рослини для фотографування. Знову дві фабрики розглядалися як еталонні моделі. Рослини були розміщені на білій поверхні; один був покритий сільськогосподарським ад’ювантом (Agrotin, Bayer CropScience, Bogotá, Colombia) для імітації відкриття всіх продихів [мокрий режим (Twet)], а інший являв собою лист без будь-якого застосування [сухий режим (Tdry)] (Castro-Duque et al., 2020). Відстань між камерою та горщиком під час зйомки становила 1 м.
Індекс відносної толерантності розраховували опосередковано з використанням продихової провідності (gs) оброблених рослин порівняно з контрольними рослинами (рослини без стресової обробки та з застосованими регуляторами росту), щоб визначити толерантність оброблених генотипів, оцінених у цьому дослідженні. RTI було отримано за допомогою рівняння, адаптованого з Chávez-Arias et al. (2020).
У кожному експерименті всі фізіологічні змінні, згадані вище, визначалися та реєструвалися при 55 DAE з використанням повністю розгорнутих листків, зібраних з верхнього полога. Крім того, вимірювання проводились у ростовій камері, щоб уникнути зміни умов середовища, в якому ростуть рослини.
Дані першого та другого експериментів аналізували разом як серію експериментів. Кожна дослідна група складалася з 5 рослин, і кожна рослина становила дослідну одиницю. Проводили дисперсійний аналіз (ANOVA) (P ≤ 0,05). Коли були виявлені значні відмінності, був використаний порівняльний тест Tukey за P ≤ 0,05. Використовуйте функцію арксинуса для перетворення відсоткових значень. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Statistix v 9.0 (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA) і наносили графік за допомогою SigmaPlot (версія 10.0; Systat Software, San Jose, CA, USA). Аналіз основних компонентів проводився за допомогою програмного забезпечення InfoStat 2016 (програмне забезпечення для аналізу, Національний університет Кордови, Аргентина) для визначення найкращих досліджуваних регуляторів росту рослин.
У таблиці 1 узагальнено дисперсійний аналіз, що показує експерименти, різні обробки та їх взаємодію з фотосинтетичними пігментами листя (хлорофілом a, b, загальним вмістом і каротиноїдами), вмістом малонового діальдегіду (MDA) і проліну, а також продиховою провідністю. Вплив gs, відносний вміст води. (RWC), вміст хлорофілу, параметри флуоресценції хлорофілу альфа, температура крони (PCT) (°C), індекс стресу врожаю (CSI) та індекс відносної толерантності рослин рису при 55 DAE.
Таблиця 1. Підсумок даних ANOVA щодо фізіологічних і біохімічних змінних рису між експериментами (генотипами) і обробкою тепловим стресом.
Відмінності (P≤0,01) у фотосинтетичних пігментних взаємодіях листя, відносному вмісті хлорофілу (показання Atleaf) і параметрах флуоресценції альфа-хлорофілу між експериментами та обробками показано в таблиці 2. Високі денні та нічні температури збільшували загальний вміст хлорофілу та каротиноїдів. Розсада рису без будь-якого позакореневого обприскування фітогормонами (2,36 мг г-1 для «F67» і 2,56 мг г-1 для «F2000») порівняно з рослинами, вирощеними в оптимальних температурних умовах (2,67 мг г-1)) показали нижчий загальний вміст хлорофілу. В обох експериментах «F67» становив 2,80 мг г-1, а «F2000» становив 2,80 мг г-1. Крім того, проростки рису, оброблені комбінацією спреїв AUX і GA в умовах теплового стресу, також показали зниження вмісту хлорофілу в обох генотипах (AUX = 1,96 мг г-1 і GA = 1,45 мг г-1 для «F67»; AUX = 1,96 мг г-1 і GA = 1,45 мг г-1 для «F67»; AUX = 2,24 мг) г-1 і GA = 1,43 мг г-1 (для «F2000») в умовах теплового стресу. В умовах теплового стресу позакоренева обробка BR призвела до незначного збільшення цієї змінної в обох генотипах. Нарешті, спрей для листя CK показав найвищі значення фотосинтетичного пігменту серед усіх обробок (обробки AUX, GA, BR, SC та AC) у генотипах F67 (3,24 мг г-1) та F2000 (3,65 мг г-1). Відносний вміст хлорофілу (одиниця Atleaf) також був знижений комбінованим тепловим стресом. Найвищі значення також були зафіксовані у рослин, обприсканих КК в обох генотипах (41,66 для «F67» і 49,30 для «F2000»). Співвідношення Fv і Fv/Fm показали значні відмінності між обробками та сортами (табл. 2). Загалом серед цих змінних сорт F67 був менш чутливим до теплового стресу, ніж сорт F2000. Співвідношення Fv і Fv/Fm постраждали більше в другому експерименті. Розсада F2000 під стресом, яку не обприскували жодними фітогормонами, мала найнижчі значення Fv (2120,15) і співвідношення Fv/Fm (0,59), але позакореневе обприскування CK допомогло відновити ці значення (Fv: 2591, 89, співвідношення Fv/Fm: 0,73). , отримуючи показання, подібні до тих, що були записані на рослинах «F2000», вирощених за оптимальних температурних умов (Fv: 2955,35, співвідношення Fv/Fm: 0,73:0,72). Не було суттєвих відмінностей у початковій флуоресценції (F0), максимальній флуоресценції (Fm), максимальному фотохімічному квантовому виході ФСІІ (Fv/F0) і співвідношенні Fm/F0. Нарешті, BR показав подібну тенденцію, як і для CK (Fv 2545,06, співвідношення Fv/Fm 0,73).
Таблиця 2. Вплив комбінованого теплового стресу (40°/30°C день/ніч) на фотосинтетичні пігменти листя [загальний хлорофіл (Chl Total), хлорофіл a (Chl a), хлорофіл b (Chl b) і каротиноїди Cx+c] ефект ], відносний вміст хлорофілу (одиниця Atliff), параметри флуоресценції хлорофілу (початкові) флуоресценція (F0), максимальна флуоресценція (Fm), змінна флуоресценція (Fv), максимальна ефективність PSII (Fv/Fm), фотохімічний максимальний квантовий вихід PSII (Fv/F0) і Fm/F0 у рослинах двох генотипів рису [Federrose 67 (F67) і Federrose 2000 (F2000)] через 55 днів після поява (DAE)).
Відносний вміст води (RWC) різних оброблених рослин рису показав відмінності (P ≤ 0,05) у взаємодії між експериментальною та позакореневою обробками (рис. 1A). При обробці SA найнижчі значення були зафіксовані для обох генотипів (74,01% для F67 і 76,6% для F2000). В умовах теплового стресу RWC рослин рису обох генотипів, оброблених різними фітогормонами, значно підвищився. Загалом позакореневе внесення CK, GA, AUX або BR збільшило RWC до значень, подібних до значень рослин, вирощених в оптимальних умовах під час експерименту. Абсолютний контроль і рослини з позакореневим обприскуванням зафіксували значення близько 83% для обох генотипів. З іншого боку, gs також показали значні відмінності (P ≤ 0,01) у взаємодії експерименту та лікування (рис. 1B). Рослина абсолютного контролю (AC) також зафіксувала найвищі значення для кожного генотипу (440,65 ммоль м-2с-1 для F67 і 511,02 ммоль м-2с-1 для F2000). Рослини рису, піддані тільки комбінованому тепловому стресу, показали найнижчі значення gs для обох генотипів (150,60 ммоль м-2с-1 для F67 і 171,32 ммоль м-2с-1 для F2000). Позакоренева обробка всіма регуляторами росту рослин також збільшила g. На рослинах рису F2000, обприсканих СС, ефект позакореневого обприскування фітогормонами був більш очевидним. Ця група рослин не показала відмінностей порівняно з рослинами абсолютного контролю (AC 511,02 і CC 499,25 ммоль м-2с-1).
Рисунок 1. Вплив комбінованого теплового стресу (40°/30°C день/ніч) на відносний вміст води (RWC) (A), продихову провідність (gs) (B), виробництво малонового діальдегіду (MDA) (C) і вміст проліну. (D) у рослин двох генотипів рису (F67 і F2000) через 55 днів після появи сходів (DAE). Обробки, оцінені для кожного генотипу, включали: абсолютний контроль (AC), контроль теплового стресу (SC), тепловий стрес + ауксин (AUX), тепловий стрес + гіберелін (GA), тепловий стрес + клітинний мітоген (CK) і тепловий стрес + брасиностероїд. (BR). Кожен стовпець представляє середнє значення ± стандартна помилка п’яти точок даних (n = 5). Стовпчики, за якими йдуть різні літери, вказують на статистично значущі відмінності за критерієм Тьюкі (P ≤ 0,05). Букви зі знаком рівності означають, що середнє значення не є статистично значущим (≤ 0,05).
Вміст MDA (P ≤ 0,01) і проліну (P ≤ 0,01) також показав значні відмінності у взаємодії між експериментом і лікуванням фітогормонами (рис. 1C, D). Підвищене перекисне окислення ліпідів спостерігалося при обробці SC в обох генотипах (рис. 1C), однак рослини, оброблені спреєм регулятора росту листя, показали зниження перекисного окислення ліпідів в обох генотипах; Загалом застосування фітогормонів (CA, AUC, BR або GA) призводить до зниження перекисного окислення ліпідів (вмісту MDA). Не виявлено відмінностей між рослинами АС двох генотипів і рослинами, які перебувають під тепловим стресом і обприсканими фітогормонами (спостережувані значення ФВ у рослинах «F67» коливалися від 4,38–6,77 мкмоль г-1, а в рослинах ФВ «F2000» «спостережувані значення коливалися від 2,84 до 9,18 мкмоль г-1 (рослини). З іншого боку, Синтез проліну в рослинах «F67» був нижчим, ніж у рослинах «F2000» під комбінованим стресом, що призвело до збільшення виробництва проліну в рослинах рису, які піддалися тепловому стресу, в обох експериментах спостерігалося, що введення цих гормонів значно збільшило вміст амінокислот у рослинах F2000 (AUX і BR становили 30,44 і 18,34 мкмоль г-1) відповідно (рис. 1G).
Вплив позакореневого обприскування регулятором росту рослин і комбінованого теплового стресу на температуру крони рослин та індекс відносної толерантності (RTI) показано на малюнках 2A та B. Для обох генотипів температура рослин AC була близькою до 27°C, а рослин SC — близько 28°C. З. Було також помічено, що позакореневе оброблення CK і BR призвело до зниження температури рослин на 2–3 °C порівняно з рослинами SC (рис. 2A). ІРТ демонстрував поведінку, подібну до інших фізіологічних змінних, демонструючи значні відмінності (P ≤ 0,01) у взаємодії між експериментом і лікуванням (рис. 2B). Рослини SC показали нижчу толерантність рослин в обох генотипах (34,18% і 33,52% для рослин рису «F67» і «F2000» відповідно). Позакореневе підживлення фітогормонами покращує ІРТ у рослин, що зазнали високотемпературного стресу. Цей ефект був більш вираженим у рослин F2000, обприсканих CC, у яких RTI становив 97,69. З іншого боку, значні відмінності спостерігалися лише в індексі межі врожайності (CSI) рослин рису в умовах стресу від обприскування фактором листя (P ≤ 0,01) (рис. 2B). Лише рослини рису, які зазнали комплексного теплового стресу, показали найвище значення індексу стресу (0,816). При обприскуванні рису різними фітогормонами індекс стресу був нижчим (від 0,6 до 0,67). Нарешті, рослина рису, вирощена в оптимальних умовах, мала значення 0,138.
Рисунок 2. Вплив комбінованого теплового стресу (40°/30°C день/ніч) на температуру крони (A), індекс відносної толерантності (RTI) (B) та індекс стресу врожаю (CSI) (C) двох видів рослин. Товарні генотипи рису (F67 і F2000) піддавали різним термічним обробкам. Обробки, оцінені для кожного генотипу, включали: абсолютний контроль (AC), контроль теплового стресу (SC), тепловий стрес + ауксин (AUX), тепловий стрес + гіберелін (GA), тепловий стрес + клітинний мітоген (CK) і тепловий стрес + брасиностероїд. (BR). Комбінований тепловий стрес передбачає вплив на рослини рису високих денних і нічних температур (40°/30°C день/ніч). Кожен стовпець представляє середнє значення ± стандартна помилка п’яти точок даних (n = 5). Стовпчики, за якими йдуть різні літери, вказують на статистично значущі відмінності за критерієм Тьюкі (P ≤ 0,05). Букви зі знаком рівності означають, що середнє значення не є статистично значущим (≤ 0,05).
Аналіз основних компонентів (PCA) показав, що змінні, оцінені на рівні 55 DAE, пояснюють 66,1% фізіологічних і біохімічних реакцій рослин рису, які зазнали теплового стресу, оброблених спреєм регулятора росту (рис. 3). Вектори представляють змінні, а точки представляють регулятори росту рослин (GR). Вектори gs, вмісту хлорофілу, максимальної квантової ефективності PSII (Fv/Fm) та біохімічних параметрів (TChl, MDA та проліну) знаходяться під близькими кутами до початку координат, що вказує на високу кореляцію між фізіологічною поведінкою рослин та ними. змінна. Одна група (V) включала проростки рису, вирощені при оптимальній температурі (AT), і рослини F2000, оброблені CK і BA. При цьому більшість рослин, оброблених ГР, становили окрему групу (IV), а обробка ГА у F2000 – окрему групу (II). Навпаки, проростки рису, які піддалися тепловому стресу (групи I і III) без будь-якого позакореневого обприскування фітогормонами (обидва генотипи були SC) були розташовані в зоні, протилежній групі V, що демонструє вплив теплового стресу на фізіологію рослин. .
Рисунок 3. Біографічний аналіз впливу комбінованого теплового стресу (40°/30°C день/ніч) на рослини двох генотипів рису (F67 та F2000) через 55 днів після появи сходів (DAE). Скорочення: АС F67, абсолютний контроль F67; SC F67, контроль теплового стресу F67; AUX F67, тепловий стрес + ауксин F67; GA F67, тепловий стрес + гіберелін F67; CK F67, тепловий стрес + поділ клітини BR F67, тепловий стрес + брасиностероїд. F67; AC F2000, абсолютний контроль F2000; SC F2000, Heat Stress Control F2000; AUX F2000, тепловий стрес + ауксин F2000; GA F2000, тепловий стрес + гіберелін F2000; CK F2000, тепловий стрес + цитокінін, BR F2000, тепловий стрес + латунний стероїд; F2000.
Такі змінні, як вміст хлорофілу, продихова провідність, співвідношення Fv/Fm, CSI, MDA, RTI та вміст проліну, можуть допомогти зрозуміти адаптацію генотипів рису та оцінити вплив агрономічних стратегій в умовах теплового стресу (Sarsu et al., 2018; Quintero-Calderon et al., 2021). Метою цього експерименту було оцінити вплив застосування чотирьох регуляторів росту на фізіолого-біохімічні показники проростків рису в умовах складного теплового стресу. Тестування розсади є простим і швидким методом одночасної оцінки рослин рису залежно від розміру або стану наявної інфраструктури (Sarsu et al. 2018). Результати цього дослідження показали, що комбінований тепловий стрес викликає різні фізіологічні та біохімічні реакції у двох генотипів рису, що вказує на процес адаптації. Ці результати також вказують на те, що розпилення позакореневого регулятора росту (головним чином цитокініни та брасиностероїди) допомагає рису адаптуватися до комплексного теплового стресу, оскільки перевага головним чином впливає на gs, RWC, співвідношення Fv/Fm, фотосинтетичні пігменти та вміст проліну.
Застосування регуляторів росту допомагає покращити водний статус рослин рису в умовах теплового стресу, який може бути пов’язаний із вищим стресом і нижчою температурою крони рослин. Це дослідження показало, що серед рослин «F2000» (чутливий генотип) рослини рису, оброблені в основному CK або BR, мали вищі значення gs і нижчі значення PCT, ніж рослини, оброблені SC. Попередні дослідження також показали, що gs і PCT є точними фізіологічними індикаторами, які можуть визначати адаптивну реакцію рослин рису та вплив агрономічних стратегій на тепловий стрес (Restrepo-Diaz and Garces-Varon, 2013; Sarsu et al., 2018; Quintero). -Карр Делонг та ін., 2021). CK або BR листя посилюють g під час стресу, оскільки ці рослинні гормони можуть сприяти відкриттю продихів через синтетичні взаємодії з іншими сигнальними молекулами, такими як ABA (стимулятор закриття продихів під абіотичним стресом) (Macková та ін., 2013; Zhou та ін., 2013). 2013). ). , 2014). Розкриття продихів сприяє охолодженню листків і знижує температуру в кроні (Sonjaroon et al., 2018; Quintero-Calderón et al., 2021). З цих причин температура рослин рослин рису, обприсканих CK або BR, може бути нижчою за комбінованого теплового стресу.
Високий температурний стрес може зменшити вміст фотосинтетичного пігменту в листі (Chen та ін., 2017; Ахаммед та ін., 2018). У цьому дослідженні, коли рослини рису перебували під тепловим стресом і не обприскувалися жодними регуляторами росту рослин, фотосинтетичні пігменти мали тенденцію до зменшення в обох генотипах (табл. 2). Фенг та ін. (2013) також повідомили про значне зниження вмісту хлорофілу в листках двох генотипів пшениці, які зазнали теплового стресу. Вплив високих температур часто призводить до зниження вмісту хлорофілу, що може бути наслідком зниження біосинтезу хлорофілу, деградації пігментів або їх спільного впливу під час теплового стресу (Fahad et al., 2017). Однак рослини рису, оброблені головним чином CK і BA, збільшували концентрацію фотосинтетичних пігментів листя під тепловим стресом. Подібні результати також повідомили Jespersen і Huang (2015) і Suchsagunpanit et al. (2015), які спостерігали збільшення вмісту хлорофілу в листі після застосування зеатину та епібрасіностероїдних гормонів у траві звичайної трави та рису, які піддалися тепловому стресу, відповідно. Розумним поясненням того, чому CK і BR сприяють збільшенню вмісту хлорофілу в листі при комбінованому тепловому стресі, є те, що CK може посилити ініціацію тривалої індукції промоторів експресії (таких як промотор, що активує старіння (SAG12) або промотор HSP18) і зменшити втрату хлорофілу в листі. , затримують старіння листя та підвищують стійкість рослин до спеки (Liu et al., 2020). BR може захищати хлорофіл листя та збільшувати вміст хлорофілу листя шляхом активації або індукції синтезу ферментів, які беруть участь у біосинтезі хлорофілу в умовах стресу (Sharma et al., 2017; Siddiqui et al., 2018). Нарешті, два фітогормони (CK і BR) також сприяють експресії білків теплового шоку та покращують різні процеси метаболічної адаптації, такі як збільшення біосинтезу хлорофілу (Sharma et al., 2017; Liu et al., 2020).
Параметри флуоресценції хлорофілу a забезпечують швидкий і неруйнівний метод, який може оцінити толерантність або адаптацію рослин до умов абіотичного стресу (Chaerle та ін. 2007; Kalaji та ін. 2017). Такі параметри, як співвідношення Fv/Fm, використовувалися як індикатори адаптації рослин до стресових умов (Alvarado-Sanabria та ін. 2017; Chavez-Arias та ін. 2020). У цьому дослідженні рослини SC показали найнижчі значення цієї змінної, переважно рослини рису «F2000». Інь та ін. (2010) також виявили, що співвідношення Fv/Fm листя рису з найвищим кущенням значно знижується при температурах вище 35°C. За даними Feng et al. (2013), нижче співвідношення Fv/Fm під час теплового стресу вказує на те, що швидкість захоплення та перетворення енергії збудження реакційним центром PSII зменшується, вказуючи на те, що реакційний центр PSII розпадається під впливом тепла. Це спостереження дозволяє нам зробити висновок, що порушення в фотосинтетичному апараті більш виражені у чутливих сортів (Fedearroz 2000), ніж у стійких сортів (Fedearroz 67).
Використання CK або BR загалом підвищило ефективність PSII в складних умовах теплового стресу. Подібні результати були отримані Suchsagunpanit et al. (2015), які помітили, що застосування BR підвищило ефективність PSII в умовах теплового стресу в рисі. Кумар та ін. (2020) також виявили, що рослини нуту, оброблені CK (6-бензиладеніном) і піддані тепловому стресу, збільшували співвідношення Fv/Fm, зробивши висновок, що позакореневе внесення CK шляхом активації циклу пігменту зеаксантина сприяє активності PSII. Крім того, спрей для листя BR сприяв фотосинтезу PSII в умовах комбінованого стресу, що вказує на те, що застосування цього фітогормону призвело до зменшення розсіювання енергії збудження антен PSII і сприяло накопиченню невеликих білків теплового шоку в хлоропластах (Ogweno et al. 2008; Kothari and Lachowitz). , 2021).
Вміст MDA і проліну часто збільшується, коли рослини перебувають у стані абіотичного стресу, порівняно з рослинами, вирощеними в оптимальних умовах (Alvarado-Sanabria et al. 2017). Попередні дослідження також показали, що рівні MDA та проліну є біохімічними індикаторами, які можна використовувати для розуміння процесу адаптації або впливу агрономічних методів вирощування рису за денних або нічних високих температур (Alvarado-Sanabria та ін., 2017; Quintero-Calderón та ін., 2021). Ці дослідження також показали, що вміст MDA і проліну, як правило, був вищим у рослинах рису, які піддавалися впливу високих температур вночі або вдень відповідно. Проте позакореневе обприскування CK і BR сприяло зниженню MDA і підвищенню рівня проліну, головним чином у толерантного генотипу (Federroz 67). Спрей CK може сприяти надмірній експресії цитокініноксидази/дегідрогенази, тим самим збільшуючи вміст захисних сполук, таких як бетаїн і пролін (Liu et al., 2020). BR сприяє індукції осмопротекторів, таких як бетаїн, цукри та амінокислоти (включаючи вільний пролін), підтримуючи клітинний осмотичний баланс за багатьох несприятливих умов навколишнього середовища (Kothari and Lachowiec, 2021).
Індекс стресу культури (CSI) та індекс відносної толерантності (RTI) використовуються для визначення того, чи допомагають оцінювані обробки пом’якшити різні стреси (абіотичні та біотичні) і позитивно впливають на фізіологію рослин (Castro-Duque та ін., 2020; Chavez-Arias та ін., 2020). Значення CSI можуть коливатися від 0 до 1, що представляє нестресові та стресові умови відповідно (Lee et al., 2010). Значення CSI для рослин, які піддалися тепловому стресу (SC), коливаються від 0,8 до 0,9 (рис. 2B), що вказує на негативний вплив комбінованого стресу на рослини рису. Проте позакореневе обприскування BC (0,6) або CK (0,6) переважно призводило до зниження цього показника в умовах абіотичного стресу порівняно з SC рослинами рису. У рослинах F2000 RTI продемонстрував вищий приріст при використанні CA (97,69%) і BC (60,73%) порівняно з SA (33,52%), що вказує на те, що ці регулятори росту рослин також сприяють покращенню реакції рису на толерантність композиції. Перегріватися. Ці показники були запропоновані для управління стресовими умовами у різних видів. Дослідження, проведене Lee et al. (2010) показали, що CSI двох сортів бавовнику при помірному водному стресі становив близько 0,85, тоді як значення CSI добре зрошуваних сортів коливалися від 0,4 до 0,6, зробивши висновок, що цей індекс є показником водної адаптації сортів. стресові стани. Крім того, Chavez-Arias et al. (2020) оцінили ефективність синтетичних еліситорів як комплексної стратегії управління стресом у рослин C. elegans і виявили, що рослини, обприскані цими сполуками, показали вищий RTI (65%). Виходячи з вищесказаного, CK і BR можна розглядати як агрономічні стратегії, спрямовані на підвищення стійкості рису до комплексного теплового стресу, оскільки ці регулятори росту рослин викликають позитивні біохімічні та фізіологічні реакції.
В останні кілька років дослідження рису в Колумбії були зосереджені на оцінці генотипів, стійких до високих денних і нічних температур, за допомогою фізіологічних або біохімічних ознак (Sánchez-Reinoso та ін., 2014; Альварадо-Санабрія та ін., 2021). Проте в останні кілька років аналіз практичних, економічних і прибуткових технологій стає дедалі важливішим, щоб запропонувати інтегроване управління рослинництвом, щоб покращити вплив складних періодів теплового стресу в країні (Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderon et al., 2021). Таким чином, спостережені в цьому дослідженні фізіологічні та біохімічні реакції рослин рису на складний тепловий стрес (40°C вдень/30°C вночі) свідчать про те, що позакореневе обприскування CK або BR може бути відповідним методом управління культурами для пом’якшення несприятливих ефектів. Вплив періодів помірного теплового стресу. Ці обробки покращили толерантність обох генотипів рису (низький CSI та високий RTI), демонструючи загальну тенденцію у фізіологічних та біохімічних реакціях рослин під комбінованим тепловим стресом. Основною реакцією рослин рису було зниження вмісту ГК, загального хлорофілу, хлорофілів α і β та каротиноїдів. Крім того, рослини страждають від пошкодження PSII (зниження параметрів флуоресценції хлорофілу, таких як співвідношення Fv/Fm) і посилення перекисного окислення ліпідів. З іншого боку, коли рис обробляли CK і BR, ці негативні ефекти були пом’якшені, а вміст проліну збільшився (рис. 4).
Рисунок 4. Концептуальна модель впливу комбінованого теплового стресу та розпилення регулятора росту листя на рослини рису. Червоні та сині стрілки вказують на негативний або позитивний вплив взаємодії між тепловим стресом і позакореневим внесенням BR (брасиностероїду) і CK (цитокініну) на фізіологічні та біохімічні реакції відповідно. gs: устьична провідність; Total Chl: загальний вміст хлорофілу; Chl α: вміст хлорофілу β; Cx+c: вміст каротиноїдів;
Таким чином, фізіологічні та біохімічні реакції в цьому дослідженні показують, що рослини рису Fedearroz 2000 більш чутливі до періоду комплексного теплового стресу, ніж рослини рису Fedearroz 67. Усі регулятори росту, оцінені в цьому дослідженні (ауксини, гібереліни, цитокініни або брасиностероїди), продемонстрували певний ступінь комбінованого зниження теплового стресу. Однак цитокінін і брасиностероїди індукували кращу адаптацію рослин, оскільки обидва регулятори росту рослин підвищували вміст хлорофілу, параметри флуоресценції альфа-хлорофілу, gs і RWC порівняно з рослинами рису без будь-якого застосування, а також знижували вміст MDA і температуру навісу. Підсумовуючи, ми робимо висновок, що використання регуляторів росту рослин (цитокінінів і брасиностероїдів) є корисним інструментом у управлінні стресовими умовами в посівах рису, спричиненими сильним тепловим стресом у періоди високих температур.
Оригінальні матеріали, наведені в дослідженні, включені до статті, а за подальшими запитами можна звертатися до відповідного автора.