Білки ДЕЛЛА консервативнірегулятори ростуякі відіграють центральну роль у розвитку рослин у відповідь на внутрішні та зовнішні сигнали. Як транскрипційні регулятори, ДЕЛЛ зв'язуються з транскрипційними факторами (ТФ) та гістоном H2A через свої GRAS-домени та залучаються до дії на промотори. Недавні дослідження показали, що стабільність ДЕЛЛ регулюється посттрансляційно двома механізмами: поліубіквітинуванням, індукованим рослинним гормономгіберелін, що призводить до їх швидкої деградації, та кон'югації з малим убіквітин-подібним модифікатором (SUMO), що збільшує їх накопичення. Більше того, активність CYP3A4 динамічно регулюється двома різними механізмами глікозилювання: O-фукозилювання посилює взаємодію CYP3A4-TF, тоді як модифікація O-зв'язаного N-ацетилглюкозаміну (O-GlcNAc) пригнічує взаємодію CYP3A4-TF. Однак роль фосфорилювання CYP3A4 неясна, оскільки попередні дослідження показали суперечливі результати, деякі з яких припускають, що фосфорилювання сприяє або пригнічує деградацію CYP3A4, а інші - що фосфорилювання не впливає на їх стабільність. Тут ми ідентифікуємо сайти фосфорилювання в репресорі GA1-3 (RGA), AtDELLA, очищеному з Arabidopsis thaliana за допомогою мас-спектрометрії, і показуємо, що фосфорилювання двох пептидів RGA в областях PolyS та PolyS/T посилює активність RGA, сприяючи зв'язуванню H2A та асоціації RGA з цільовими промоторами. Примітно, що фосфорилювання не впливало на взаємодію RGA-TF або стабільність RGA. Наше дослідження розкриває молекулярний механізм, за допомогою якого фосфорилювання індукує активність CYP3A4.
Наш мас-спектрометричний аналіз показав, що як Pep1, так і Pep2 були високо фосфорильовані в RGA на тлі дефіциту GA1. На додаток до цього дослідження, фосфопротеомічні дослідження також виявили фосфорилювання Pep1 в RGA, хоча його роль ще не вивчена53,54,55. Навпаки, фосфорилювання Pep2 раніше не було описано, оскільки цей пептид можна було виявити лише за допомогою трансгену RGAGKG. Хоча мутація m1A, яка скасувала фосфорилювання Pep1, лише незначно знизила активність RGA in planta, вона мала адитивний ефект у поєднанні з m2A у зниженні активності RGA (Додатковий Рисунок 6). Важливо, що фосфорилювання Pep1 було значно знижено у мутанта sly1 з посиленням GA порівняно з ga1, що свідчить про те, що GA сприяє дефосфорилюванню RGA, знижуючи його активність. Механізм, за допомогою якого GA пригнічує фосфорилювання RGA, потребує подальшого дослідження. Одна з можливостей полягає в тому, що це досягається шляхом регуляції неідентифікованої протеїнкінази. Хоча дослідження показали, що експресія протеїнкінази CK1 EL1 знижується GA у рисі41, наші результати вказують на те, що мутації вищого порядку гомолога Arabidopsis EL1 (AEL1-4) не зменшують фосфорилювання RGA. Відповідно до наших результатів, нещодавнє фосфопротеомічне дослідження з використанням ліній Arabidopsis з надмірною експресією AEL та потрійного мутанта ael не виявило жодних білків DNA як субстратів цих кіназ56. Під час підготовки рукопису повідомлялося, що GSK3, ген, що кодує GSK3/SHAGGY-подібну кіназу у пшениці (Triticum aestivum), може фосфорилювати DNA (Rht-B1b)57, хоча фосфорилювання Rht-B1b за допомогою GSK3 не було підтверджено in planta. Ферментативні реакції in vitro у присутності GSK3 з подальшим мас-спектрометричним аналізом виявили три сайти фосфорилювання, розташовані між доменами DNA та GRAS Rht-B1b (Додатковий рис. 3). Заміни серину на аланін у всіх трьох сайтах фосфорилювання призвели до зниження активності Rht-B1b у трансгенній пшениці, що узгоджується з нашими висновками про те, що заміни аланіну в Pep2 RGA знижували активність RGA. Однак, аналізи деградації білка in vitro додатково продемонстрували, що фосфорилювання також може стабілізувати Rht-B1b57. Це суперечить нашим результатам, які показують, що заміни аланіну в Pep2 RGA не змінюють його стабільність in planta. GSK3 у пшениці є ортологом білка 2, нечутливого до брасиностероїдів (BIN2), у Arabidopsis 57. BIN2 є негативним регулятором сигналізації BR, і BR активує його сигнальний шлях, викликаючи деградацію BIN2 58. Ми показали, що обробка BR не знижує стабільність RGA 59 або рівень фосфорилювання в Arabidopsis (Додатковий Рисунок 2), що свідчить про те, що RGA навряд чи фосфорилюється BIN2.
Усі кількісні дані були статистично проаналізовані за допомогою Excel, а значущі відмінності були визначені за допомогою t-критерію Стьюдента. Для попереднього визначення розміру вибірки не використовувалися статистичні методи. Жодні дані не були виключені з аналізу; експеримент не був рандомізованим; і дослідники були обізнані з розподілом під час експерименту та оцінки результатів. Розміри вибірок наведено в підписах до рисунків та у файлах необроблених даних.
Час публікації: 15 квітня 2025 р.