Білки ДЕЛЛА консервативнірегулятори ростуякі відіграють центральну роль у розвитку рослин у відповідь на внутрішні та зовнішні сигнали. Як регулятори транскрипції, DELLA зв’язуються з факторами транскрипції (TF) і гістоном H2A через свої домени GRAS і залучаються для дії на промотори. Нещодавні дослідження показали, що стабільність DELLA регулюється посттрансляційно двома механізмами: поліубіквітуванням, індукованим рослинним гормономгіберелін, що призводить до їх швидкої деградації та кон’югації з малим убіквітиноподібним модифікатором (SUMO), що збільшує їх накопичення. Крім того, активність DELLA динамічно регулюється двома різними механізмами глікозилювання: O-фукозилювання посилює взаємодію DELLA-TF, тоді як модифікація N-ацетилглюкозаміну (O-GlcNAc), пов’язана з O, інгібує взаємодію DELLA-TF. Однак роль фосфорилювання DELLA незрозуміла, оскільки попередні дослідження показали суперечливі результати, при цьому деякі припускають, що фосфорилювання сприяє або пригнічує деградацію DELLA, а інші припускають, що фосфорилювання не впливає на їх стабільність. Тут ми ідентифікуємо сайти фосфорилювання в репресорі GA1-3 (RGA), AtDELLA, очищеному з Arabidopsis thaliana за допомогою мас-спектрометрії, і показуємо, що фосфорилювання двох пептидів RGA в областях PolyS і PolyS/T посилює активність RGA шляхом сприяння зв’язуванню H2A та асоціації RGA з цільовими промоторами. Примітно, що фосфорилювання не вплинуло на взаємодію RGA-TF або стабільність RGA. Наше дослідження розкриває молекулярний механізм, за допомогою якого фосфорилювання викликає активність DELLA.
Наш мас-спектрометричний аналіз показав, що і Pep1, і Pep2 були сильно фосфорильовані в RGA на фоні Ga1 з дефіцитом GA. На додаток до цього дослідження, фосфопротеомні дослідження також виявили фосфорилювання Pep1 в RGA, хоча його роль ще не вивчена53,54,55. Навпаки, фосфорилювання Pep2 раніше не було описано, оскільки цей пептид можна було виявити лише за допомогою трансгену RGAGKG. Хоча мутація m1A, яка скасувала фосфорилювання Pep1, лише трохи знизила активність RGA у planta, вона мала додатковий ефект у поєднанні з m2A у зниженні активності RGA (додатковий малюнок 6). Важливо, що фосфорилювання Pep1 було значно знижене в GA-посиленому мутанті sly1 порівняно з ga1, що свідчить про те, що GA сприяє дефосфорилюванню RGA, знижуючи його активність. Механізм, за допомогою якого GA пригнічує фосфорилювання RGA, потребує подальшого дослідження. Однією з можливостей є те, що це досягається шляхом регуляції неідентифікованої протеїнкінази. Хоча дослідження показали, що експресія протеїнкінази CK1 EL1 знижується GA в рисі41, наші результати показують, що мутації вищого порядку гомолога EL1 Arabidopsis (AEL1-4) не зменшують фосфорилювання RGA. Згідно з нашими результатами, нещодавнє фосфопротеомічне дослідження з використанням ліній надекспресії AEL Arabidopsis і потрійного мутанта ael не ідентифікувало жодних білків DELLA як субстратів цих кіназ56. Коли ми готували рукопис, повідомлялося, що GSK3, ген, який кодує GSK3/SHAGGY-подібну кіназу в пшениці (Triticum aestivum), може фосфорилювати DELLA (Rht-B1b)57, хоча фосфорилювання Rht-B1b GSK3 не було підтверджено на рослинах. Ферментативні реакції in vitro в присутності GSK3 з подальшим мас-спектрометричним аналізом виявили три сайти фосфорилювання, розташовані між доменами DELLA і GRAS Rht-B1b (додаткова рис. 3). Заміни серину на аланін у всіх трьох сайтах фосфорилювання призвели до зниження активності Rht-B1b у трансгенній пшениці, що узгоджується з нашими висновками про те, що заміни аланіну в Pep2 RGA зменшили активність RGA. Проте аналізи деградації білка in vitro додатково продемонстрували, що фосфорилювання також може стабілізувати Rht-B1b57. Це суперечить нашим результатам, які показують, що заміни аланіну в Pep2 RGA не змінюють його стабільність у planta. GSK3 у пшениці є ортологом нечутливого до брасиностероїдів білка 2 (BIN2) у Arabidopsis 57. BIN2 є негативним регулятором передачі сигналів BR, а BR активує свій сигнальний шлях, спричиняючи деградацію BIN2 58. Ми показали, що обробка BR не знижує стабільність RGA 59 або рівень фосфорилювання у Arabidopsis (додатковий малюнок 2), що свідчить про те, що RGA навряд чи фосфорильується BIN2.
Усі кількісні дані були статистично проаналізовані з використанням Excel, а значні відмінності були визначені за допомогою t-критерію Стьюдента. Жодні статистичні методи не використовувалися для попереднього визначення розміру вибірки. Жодні дані не були виключені з аналізу; експеримент не був рандомізований; і дослідники знали про розподіл під час експерименту та оцінки результатів. Розміри зразків наведено в легендах до малюнків і у файлах необроблених даних.
Час публікації: 15 квітня 2025 р