У цьому дослідженні оцінювали летальність, сублетальність та токсичність комерційнихциперметринФормули для пуголовків безхвостих ануранів. У гострому тесті концентрації 100–800 мкг/л тестувалися протягом 96 годин. У хронічному тесті природні концентрації циперметрину (1, 3, 6 та 20 мкг/л) тестувалися на смертність, а потім проводилося мікроядерне тестування та ядерні аномалії еритроцитів протягом 7 днів. LC50 комерційної форми циперметрину для пуголовків становила 273,41 мкг/л. У хронічному тесті найвища концентрація (20 мкг/л) призвела до смертності понад 50%, оскільки вона знищила половину протестованих пуголовків. Мікроядерний тест показав значні результати при 6 та 20 мкг/л, і було виявлено кілька ядерних аномалій, що вказує на генотоксичний потенціал комерційної форми циперметрину проти P. gracilis. Циперметрин становить високий ризик для цього виду, що вказує на те, що він може спричинити численні проблеми та впливати на динаміку цієї екосистеми в короткостроковій та довгостроковій перспективі. Отже, можна зробити висновок, що комерційні препарати циперметрину мають токсичний вплив на P. gracilis.
Через постійне розширення сільськогосподарської діяльності та інтенсивне застосуванняборотьба зі шкідникамизаходи, водні тварини часто піддаються впливу пестицидів1,2. Забруднення водних ресурсів поблизу сільськогосподарських полів може впливати на розвиток та виживання нецільових організмів, таких як амфібії.
Амфібії стають дедалі важливішими в оцінці екологічних матриць. Безхвостих риб вважають хорошими біоіндикаторами забруднювачів навколишнього середовища завдяки їхнім унікальним характеристикам, таким як складні життєві цикли, швидкі темпи росту личинок, трофічний статус, проникна шкіра10,11, залежність від води для розмноження12 та незахищені яйця11,13,14. Мала водяна жаба (Physalaemus gracilis), широко відома як плакуча жаба, була показана як вид біоіндикатора забруднення пестицидами4,5,6,7,15. Цей вид зустрічається у стоячих водах, охоронних зонах або зонах зі змінним середовищем існування в Аргентині, Уругваї, Парагваї та Бразилії1617 та вважається стабільним за класифікацією МСОП завдяки широкому поширенню та толерантності до різних середовищ існування18.
Повідомлялося про сублетальні ефекти у амфібій після впливу циперметрину, включаючи поведінкові, морфологічні та біохімічні зміни у пуголовків23,24,25, зміну смертності та часу метаморфози, ферментативні зміни, зниження успішності вилуплення24,25, гіперактивність26, пригнічення активності холінестерази27 та зміни у плавальних характеристиках7,28. Однак дослідження генотоксичної дії циперметрину на амфібій обмежені. Тому важливо оцінити чутливість безхвостих видів до циперметрину.
Забруднення навколишнього середовища впливає на нормальний ріст і розвиток амфібій, але найсерйознішим несприятливим наслідком є генетичне пошкодження ДНК, спричинене впливом пестицидів13. Аналіз морфології клітин крові є важливим біоіндикатором забруднення та потенційної токсичності речовини для диких видів29. Мікроядерний тест є одним із найпоширеніших методів визначення генотоксичності хімічних речовин у навколишньому середовищі30. Це швидкий, ефективний та недорогий метод, який є хорошим індикатором хімічного забруднення таких організмів, як амфібії31,32, і може надати інформацію про вплив генотоксичних забруднювачів33.
Метою цього дослідження було оцінити токсичний потенціал комерційних препаратів циперметрину для дрібних водних пуголовків за допомогою мікроядерного тесту та оцінки екологічного ризику.
Кумулятивна смертність (%) пуголовків P. gracilis, що зазнали впливу різних концентрацій комерційного циперметрину протягом гострого періоду випробування.
Кумулятивна смертність (%) пуголовків P. gracilis, що зазнали впливу різних концентрацій комерційного циперметрину під час хронічного тесту.
Спостережувана висока смертність була результатом генотоксичної дії на амфібій, які зазнали впливу різних концентрацій циперметрину (6 та 20 мкг/л), про що свідчить наявність мікроядер (МЯ) та ядерних аномалій в еритроцитах. Утворення МЯ вказує на помилки в мітозі та пов'язане з поганим зв'язуванням хромосом з мікротрубочками, дефектами білкових комплексів, відповідальних за захоплення та транспорт хромосом, помилками в сегрегації хромосом та помилками в репарації пошкоджень ДНК38,39 і може бути пов'язане з окислювальним стресом, індукованим пестицидами40,41. Інші аномалії спостерігалися при всіх оцінених концентраціях. Збільшення концентрації циперметрину збільшувало ядерні аномалії в еритроцитах на 5% та 20% при найнижчій (1 мкг/л) та найвищій (20 мкг/л) дозах відповідно. Наприклад, зміни в ДНК виду можуть мати серйозні наслідки як для короткострокового, так і для довгострокового виживання, що призводить до скорочення популяції, зміни репродуктивної придатності, інбридингу, втрати генетичного різноманіття та зміни темпів міграції. Всі ці фактори можуть впливати на виживання та підтримку виду42,43. Утворення еритроїдних аномалій може свідчити про блокування цитокінезу, що призводить до аномального поділу клітин (двоядерні еритроцити)44,45; багатолопатеві ядра – це випинання ядерної мембрани з кількома частками46, тоді як інші еритроїдні аномалії можуть бути пов'язані з ампліфікацією ДНК, такі як ядерні нирки/пухирі47. Наявність без'ядерних еритроцитів може свідчити про порушення транспорту кисню, особливо у забрудненій воді48,49. Апоптоз вказує на загибель клітин50.
Інші дослідження також продемонстрували генотоксичну дію циперметрину. Кабанья та ін.51 продемонстрували наявність мікроядер та ядерних змін, таких як двоядерні клітини та апоптотичні клітини, у клітинах Odontophrynus americanus після впливу високих концентрацій циперметрину (5000 та 10 000 мкг L−1) протягом 96 годин. Апоптоз, індукований циперметрином, також був виявлений у P. biligonigerus52 та Rhinella arenarum53. Ці результати свідчать про те, що циперметрин має генотоксичну дію на низку водних організмів, і що аналіз MN та ENA може бути показником сублетального впливу на амфібій та може бути застосовним до місцевих видів та диких популяцій, що зазнали впливу токсикантів12.
Комерційні форми циперметрину становлять високу екологічну небезпеку (як гостру, так і хронічну), причому ГХ перевищують рівень Агентства з охорони навколишнього середовища США (EPA)54, що може негативно вплинути на вид, якщо він присутній у навколишньому середовищі. В оцінці хронічного ризику NOEC для смертності становив 3 мкг L−1, що підтверджує, що концентрації, виявлені у воді, можуть становити ризик для виду55. Летальний NOEC для личинок R. arenarum, які зазнали впливу суміші ендосульфану та циперметрину, становив 500 мкг L−1 через 168 годин; це значення знизилося до 0,0005 мкг L−1 через 336 годин. Автори показують, що чим довше триває вплив, тим нижчі концентрації, шкідливі для виду. Важливо також підкреслити, що значення NOEC були вищими, ніж у P. gracilis за той самий час впливу, що вказує на видоспецифічність реакції виду на циперметрин. Крім того, що стосується смертності, значення CHQ P. gracilis після впливу циперметрину досягло 64,67, що перевищує референтне значення, встановлене Агентством з охорони навколишнього середовища США54, а значення CHQ личинок R. arenarum також було вищим за це значення (CHQ > 388,00 через 336 годин), що вказує на високий ризик для кількох видів земноводних. Враховуючи, що P. gracilis потрібно приблизно 30 днів для завершення метаморфози56, можна зробити висновок, що досліджувані концентрації циперметрину можуть сприяти скороченню популяції, запобігаючи переходу інфікованих особин у дорослу або репродуктивну стадію в ранньому віці.
У розрахунковій оцінці ризику мікроядер та інших ядерних аномалій еритроцитів значення CHQ коливалися від 14,92 до 97,00, що вказує на потенційний генотоксичний ризик циперметрину для P. gracilis навіть у його природному середовищі існування. З урахуванням смертності, максимальна концентрація ксенобіотичних сполук, переносима P. gracilis, становила 4,24 мкг/л. Однак, концентрації до 1 мкг/л також демонстрували генотоксичні ефекти. Цей факт може призвести до збільшення кількості аномальних особин57 та вплинути на розвиток і розмноження видів у їхніх середовищах існування, що призведе до скорочення популяцій амфібій.
Комерційні форми інсектициду циперметрину показали високу гостру та хронічну токсичність для P. gracilis. Спостерігалися вищі показники смертності, ймовірно, через токсичний вплив, про що свідчить наявність мікроядер та ядерних аномалій еритроцитів, особливо зубчастих ядер, лопатевих ядер та везикулярних ядер. Крім того, досліджувані види демонстрували підвищені екологічні ризики, як гострі, так і хронічні. Ці дані, у поєднанні з попередніми дослідженнями нашої дослідницької групи, показали, що навіть різні комерційні форми циперметрину все ще викликали зниження активності ацетилхолінестерази (AChE) та бутирилхолінестерази (BChE) та оксидативний стрес58, а також призводили до змін у активності плавання та мальформацій ротової порожнини59 у P. gracilis, що вказує на те, що комерційні форми циперметрину мають високу летальну та сублетальну токсичність для цього виду. Хартманн та ін.60 виявили, що комерційні форми циперметрину були найбільш токсичними для P. gracilis та іншого виду того ж роду (P. cuvieri) порівняно з дев'ятьма іншими пестицидами. Це говорить про те, що законодавчо дозволені концентрації циперметрину для захисту довкілля можуть призвести до високої смертності та довгострокового скорочення популяції.
Необхідні подальші дослідження для оцінки токсичності пестициду для амфібій, оскільки концентрації, виявлені в навколишньому середовищі, можуть спричинити високу смертність і становити потенційний ризик для P. gracilis. Слід заохочувати дослідження видів амфібій, оскільки даних про ці організми недостатньо, особливо про бразильські види.
Випробування на хронічну токсичність тривало 168 годин (7 днів) у статичних умовах, а сублетальні концентрації становили: 1, 3, 6 та 20 мкг д.р./л. В обох експериментах було оцінено 10 пуголовків на групу лікування у шести повторностях, загалом 60 пуголовків на концентрацію. Тим часом, обробка лише водою слугувала негативним контролем. Кожна експериментальна установка складалася зі стерильної скляної чашки місткістю 500 мл та щільністю 1 пуголовок на 50 мл розчину. Колбу накривали поліетиленовою плівкою для запобігання випаровуванню та постійно аерували.
Воду було проаналізовано хімічно для визначення концентрації пестицидів через 0, 96 та 168 годин. Згідно з Сабіном та ін. [68] та Мартінсом та ін. [69], аналізи проводилися в Лабораторії аналізу пестицидів (LARP) Федерального університету Санта-Марії з використанням газової хроматографії у поєднанні з потрійною квадрупольною мас-спектрометрією (Varian model 1200, Пало-Альто, Каліфорнія, США). Кількісне визначення пестицидів у воді наведено як додатковий матеріал (Таблиця SM1).
Для мікроядерного тесту (МНТ) та тесту на ядерні аномалії еритроцитів (РНК) було проаналізовано 15 пуголовків з кожної групи лікування. Пуголовків анестезували 5% лідокаїном (50 мг г-170), а зразки крові збирали шляхом серцевої пункції за допомогою одноразових гепаринізованих шприців. Мазки крові готували на стерильних предметних стеклах мікроскопа, сушили на повітрі, фіксували 100% метанолом (4 °C) протягом 2 хвилин, а потім фарбували 10% розчином Гімзи протягом 15 хвилин у темряві. Після завершення процесу предметні стекла промивали дистильованою водою для видалення надлишків барвника та сушили при кімнатній температурі.
Щонайменше 1000 еритроцитів з кожного пуголовка було проаналізовано за допомогою 100-кратного мікроскопа з об'єктивом 71 для визначення наявності MN та ENA. Загалом було оцінено 75 796 еритроцитів з пуголовків, враховуючи концентрації циперметрину та контрольні групи. Генотоксичність аналізували за методом Карраско та ін. та Фенека та ін.38,72, визначаючи частоту наступних ядерних уражень: (1) без'ядерні клітини: клітини без ядер; (2) апоптотичні клітини: фрагментація ядра, запрограмована клітинна смерть; (3) дво'ядерні клітини: клітини з двома ядрами; (4) ядерні бруньки або бульбашки: клітини з ядрами з невеликими виступами ядерної мембрани, бульбашки, подібні за розміром до мікроядер; (5) каріолізовані клітини: клітини лише з контуром ядра без внутрішнього матеріалу; (6) клітини з виїмками: клітини з ядрами з очевидними тріщинами або виїмками у своїй формі, які також називаються ядрами ниркоподібної форми; (7) часточкові клітини: клітини з ядерними виступами, більшими за вищезгадані везикули; та (8) мікроклітини: клітини з конденсованими ядрами та зменшеною цитоплазмою. Зміни порівнювали з результатами негативного контролю.
Результати випробувань на гостру токсичність (LC50) були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення GBasic та методу TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Дані хронічного випробування були попередньо перевірені на нормальність помилок (Шапіро-Вілкс) та однорідність дисперсії (Бартлетт). Результати були проаналізовані за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA). Для порівняння даних між собою використовувався тест Тьюкі, а для порівняння даних між групою лікування та групою негативного контролю – тест Даннета.
Дані LOEC та NOEC аналізували за допомогою тесту Даннета. Статистичні тести проводили за допомогою програмного забезпечення Statistica 8.0 (StatSoft) з рівнем значущості 95% (p < 0,05).
Час публікації: 13 березня 2025 р.