Це дослідження оцінювало летальність, сублетальність і токсичність комерційного продуктуциперметринрецептури для пуголовків анурових. У гострому тесті концентрації 100–800 мкг/л перевіряли протягом 96 годин. У хронічному тесті природні концентрації циперметрину (1, 3, 6 і 20 мкг/л) перевіряли на смертність, а потім проводили тестування мікроядер і ядерних аномалій еритроцитів протягом 7 днів. LC50 комерційної форми циперметрину для пуголовків становила 273,41 мкг/л. У хронічному тесті найвища концентрація (20 мкг/л) призвела до більш ніж 50% смертності, оскільки вбила половину тестованих пуголовків. Мікронуклеарний тест показав значні результати при 6 і 20 мкг/л, і було виявлено кілька ядерних аномалій, що вказує на те, що комерційна композиція циперметрину має генотоксичний потенціал проти P. gracilis. Циперметрин становить високий ризик для цього виду, що вказує на те, що він може спричинити численні проблеми та вплинути на динаміку цієї екосистеми в короткостроковій та довгостроковій перспективі. Отже, можна зробити висновок, що комерційні препарати циперметрину мають токсичну дію на P. gracilis.
Завдяки постійному розширенню сільськогосподарської діяльності та інтенсивному застосуваннюборотьба зі шкідникамиВодні тварини часто піддаються впливу пестицидів1,2. Забруднення водних ресурсів поблизу сільськогосподарських полів може вплинути на розвиток і виживання нецільових організмів, таких як амфібії.
Амфібії стають все більш важливими в оцінці екологічних матриць. Анурани вважаються хорошими біоіндикаторами забруднювачів навколишнього середовища через їх унікальні характеристики, такі як складні життєві цикли, швидкі темпи росту личинок, трофічний статус, проникна шкіра10,11, залежність від води для розмноження12 та незахищені яйця11,13,14. Було показано, що маленька водяна жаба (Physalaemus gracilis), широко відома як плакуча жаба, є біоіндикатором забруднення пестицидами4,5,6,7,15. Вид зустрічається в стоячих водах, охоронюваних територіях або територіях зі змінним середовищем проживання в Аргентині, Уругваї, Парагваї та Бразилії1617 та вважається стабільним за класифікацією МСОП через його широке поширення та толерантність до різних середовищ існування18.
Повідомлялося про сублетальні наслідки у амфібій після впливу циперметрину, включаючи поведінкові, морфологічні та біохімічні зміни у пуголовків23,24,25, зміну смертності та часу метаморфозу, ферментативні зміни, зниження успіху вилуплення24,25, гіперактивність26, пригнічення активності холінестерази27 та зміни в плаванні7,28. Проте дослідження генотоксичної дії циперметрину на амфібій обмежені. Тому важливо оцінити чутливість видів анурану до циперметрину.
Забруднення навколишнього середовища впливає на нормальний ріст і розвиток земноводних, але найбільш серйозним несприятливим ефектом є генетичне пошкодження ДНК, викликане впливом пестицидів13. Аналіз морфології клітин крові є важливим біоіндикатором забруднення та потенційної токсичності речовини для диких видів29. Мікроядерний тест є одним із найбільш часто використовуваних методів визначення генотоксичності хімічних речовин у навколишньому середовищі30. Це швидкий, ефективний і недорогий метод, який є гарним індикатором хімічного забруднення організмів, таких як амфібії31,32, і може надати інформацію про вплив генотоксичних забруднюючих речовин33.
Метою цього дослідження було оцінити токсичний потенціал комерційних препаратів циперметрину для дрібних водних пуголовків за допомогою мікроядерного тесту та оцінки екологічного ризику.
Кумулятивна смертність (%) пуголовків P. gracilis підданих різним концентраціям комерційного циперметрину протягом гострого періоду тесту.
Сукупна смертність (%) пуголовків P. gracilis підданих різним концентраціям комерційного циперметрину під час тривалого тесту.
Спостережувана висока смертність була результатом генотоксичних ефектів у амфібій, які піддавалися впливу різних концентрацій циперметрину (6 і 20 мкг/л), про що свідчить наявність мікроядер (МЯ) і ядерних аномалій в еритроцитах. Формування MN вказує на помилки в мітозі та пов’язане з поганим зв’язуванням хромосом з мікротрубочками, дефектами в білкових комплексах, відповідальних за поглинання та транспортування хромосом, помилками в сегрегації хромосом і помилками у відновленні пошкоджень ДНК38,39 і може бути пов’язано з окислювальним стресом, спричиненим пестицидами40,41. Інші аномалії спостерігалися при всіх оцінених концентраціях. Підвищення концентрації циперметрину збільшувало ядерні аномалії в еритроцитах на 5% і 20% при найнижчій (1 мкг/л) і найвищій (20 мкг/л) дозах відповідно. Наприклад, зміни в ДНК виду можуть мати серйозні наслідки як для короткострокового, так і для довгострокового виживання, що призведе до зменшення популяції, зміни репродуктивної здатності, інбридингу, втрати генетичного різноманіття та зміни темпів міграції. Усі ці фактори можуть впливати на виживання та збереження виду42,43. Утворення еритроїдних аномалій може вказувати на блок цитокінезу, що призводить до аномального поділу клітин (двоядерні еритроцити)44,45; багатолопатеві ядра є випинаннями ядерної мембрани з кількома часточками46, тоді як інші еритроїдні аномалії можуть бути пов’язані з ампліфікацією ДНК, такі як ядерні нирки/пухлинки47. Наявність без'ядерних еритроцитів може свідчити про порушення транспорту кисню, особливо в забрудненій воді48,49. Апоптоз вказує на загибель клітин50.
Інші дослідження також продемонстрували генотоксичну дію циперметрину. Kabaña et al.51 продемонстрували наявність мікроядер і ядерних змін, таких як двоядерні клітини та апоптотичні клітини в клітинах Odontophrynus americanus після впливу високих концентрацій циперметрину (5000 і 10 000 мкг L-1) протягом 96 годин. Індукований циперметрином апоптоз також був виявлений у P. biligonigerus52 і Rhinella arenarum53. Ці результати свідчать про те, що циперметрин має генотоксичну дію на низку водних організмів і що аналіз MN і ENA може бути індикатором сублетального впливу на амфібій і може бути застосований до місцевих видів і диких популяцій, які піддаються впливу токсикантів12.
Комерційні препарати циперметрину становлять високу небезпеку для навколишнього середовища (як гостру, так і хронічну), причому HQ перевищує рівень54 Агентства з охорони навколишнього середовища США (EPA), що може негативно вплинути на види, якщо вони присутні в навколишньому середовищі. При оцінці хронічного ризику NOEC для смертності становив 3 мкг/л, підтверджуючи, що концентрації, виявлені у воді, можуть становити ризик для виду55. Летальний NOEC для личинок R. arenarum, які піддалися впливу суміші ендосульфану та циперметрину, становив 500 мкг/л через 168 годин; це значення знизилося до 0,0005 мкг/л через 336 год. Автори показують, що чим довша експозиція, тим менші концентрації шкідливі для виду. Важливо також підкреслити, що значення NOEC були вищими, ніж у P. gracilis за той самий час експозиції, що вказує на видоспецифічну реакцію на циперметрин. Крім того, з точки зору смертності, значення CHQ P. gracilis після впливу циперметрину досягло 64,67, що вище контрольного значення, встановленого Агентством з охорони навколишнього середовища США54, а значення CHQ личинок R. arenarum також було вищим за це значення (CHQ > 388,00 через 336 годин), що вказує на те, що досліджувані інсектициди становлять високий ризик для кількох види земноводних. Враховуючи, що для завершення метаморфозу P. gracilis потрібно приблизно 30 днів56, можна зробити висновок, що досліджені концентрації циперметрину можуть сприяти зменшенню популяції, запобігаючи переходу інфікованих особин у дорослу або репродуктивну стадію в ранньому віці.
У розрахованій оцінці ризику мікроядер та інших ядерних аномалій еритроцитів значення CHQ коливалися від 14,92 до 97,00, що вказує на потенційний генотоксичний ризик циперметрину для P. gracilis навіть у його природному середовищі існування. З урахуванням смертності максимальна концентрація ксенобіотичних сполук, переносима P. gracilis, становила 4,24 мкг/л. Однак концентрації до 1 мкг/л також показали генотоксичну дію. Цей факт може призвести до збільшення кількості аномальних особин57 і вплинути на розвиток і розмноження видів у місцях їх існування, що призведе до зменшення популяції земноводних.
Комерційні препарати інсектициду циперметрин показали високу гостру та хронічну токсичність для P. gracilis. Спостерігалися вищі показники смертності, ймовірно, через токсичні ефекти, про що свідчить наявність мікроядер і аномалій ядер еритроцитів, особливо зубчастих ядер, часткових ядер і везикулярних ядер. Крім того, досліджувані види показали підвищені екологічні ризики, як гострі, так і хронічні. Ці дані в поєднанні з попередніми дослідженнями, проведеними нашою дослідницькою групою, показали, що навіть різні комерційні форми циперметрину все ще спричиняли зниження активності ацетилхолінестерази (AChE) і бутирилхолінестерази (BChE) та окисного стресу58, а також призводили до змін активності плавання та вад розвитку порожнини рота59 у P. gracilis, що вказує на те, що комерційні форми циперметрину мають високу летальну та сублетальну токсичність для цього видів. Гартман та ін. 60 виявили, що комерційні препарати циперметрину були найбільш токсичними для P. gracilis та іншого виду того ж роду (P. cuvieri) порівняно з дев’ятьма іншими пестицидами. Це свідчить про те, що законодавчо дозволені концентрації циперметрину для захисту навколишнього середовища можуть призвести до високої смертності та тривалого скорочення популяції.
Необхідні подальші дослідження, щоб оцінити токсичність пестициду для земноводних, оскільки концентрації, виявлені в навколишньому середовищі, можуть спричинити високу смертність і становити потенційний ризик для P. gracilis. Слід заохочувати дослідження видів амфібій, оскільки даних про ці організми мало, особливо про бразильські види.
Тест на хронічну токсичність тривав 168 годин (7 днів) у статичних умовах, а сублетальні концентрації становили: 1, 3, 6 і 20 мкг ai L-1. В обох експериментах 10 пуголовків на групу лікування оцінювали за шістьма повторами, загалом 60 пуголовків на концентрацію. Тим часом лікування лише водою служило негативним контролем. Кожна дослідна установка складалася зі стерильного скляного посуду місткістю 500 мл і щільністю 1 пуголовок на 50 мл розчину. Колбу накривали поліетиленовою плівкою для запобігання випаровуванню і безперервно аерували.
Воду хімічно аналізували для визначення концентрації пестицидів через 0, 96 і 168 годин. Згідно з Sabin et al. 68 та Martins et al. 69, аналізи проводилися в Лабораторії аналізу пестицидів (LARP) Федерального університету Санта-Марія з використанням газової хроматографії в поєднанні з потрійною квадрупольною мас-спектрометрією (модель Varian 1200, Пало-Альто, Каліфорнія, США). Кількісне визначення пестицидів у воді показано як додатковий матеріал (таблиця SM1).
Для мікроядерного тесту (MNT) і тесту ядерної аномалії еритроцитів (РНК) було проаналізовано 15 пуголовків з кожної групи лікування. Пуголовків анестезували 5% лідокаїном (50 мг g-170) і відбирали зразки крові за допомогою пункції серця за допомогою одноразових гепаринізованих шприців. Мазки крові готували на стерильних предметних стеклах мікроскопа, висушували на повітрі, фіксували 100% метанолом (4 °C) протягом 2 хв, а потім фарбували 10% розчином Гімзи протягом 15 хв у темряві. Наприкінці процесу предметні скла промивали дистильованою водою для видалення надлишку плями та висушували при кімнатній температурі.
Щонайменше 1000 еритроцитів кожного пуголовка аналізували за допомогою 100× мікроскопа з об’єктивом 71 для визначення присутності MN та ENA. Загалом 75 796 еритроцитів у пуголовків було оцінено з урахуванням концентрації циперметрину та контролю. Генотоксичність аналізували за методом Carrasco et al. та Fenech et al.38,72 шляхом визначення частоти таких ядерних уражень: (1) без’ядерні клітини: клітини без ядер; (2) апоптотичні клітини: ядерна фрагментація, запрограмована клітинна смерть; (3) двоядерні клітини: клітини з двома ядрами; (4) ядерні бруньки або пухирчасті клітини: клітини з ядрами з невеликими виступами ядерної мембрани, бульбашки, схожі за розміром на мікроядра; (5) каріолізовані клітини: клітини лише з контуром ядра без внутрішнього матеріалу; (6) клітини з виїмками: клітини з ядрами з явними тріщинами або виїмками у формі, які також називають ниркоподібними ядрами; (7) часточкові клітини: клітини з ядерними виступами, більшими за вищезгадані везикули; і (8) мікроклітини: клітини з конденсованими ядрами і зменшеною цитоплазмою. Зміни порівнювали з результатами негативного контролю.
Результати тесту на гостру токсичність (LC50) аналізували за допомогою програмного забезпечення GBasic і методу TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Дані хронічного тесту були попередньо перевірені на нормальність помилок (Шапіро-Вілкс) і однорідність дисперсії (Бартлетт). Результати аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA). Тест Тьюкі використовувався для порівняння даних між собою, а тест Даннетта використовувався для порівняння даних між групою лікування та групою негативного контролю.
Дані LOEC і NOEC були проаналізовані за допомогою тесту Даннета. Статистичні тести проводили за допомогою програмного забезпечення Statistica 8.0 (StatSoft) з рівнем значущості 95% (p < 0,05).
Час публікації: 13 березня 2025 р