Сезонний розподіл опадів у провінції Гуйчжоу нерівномірний, з більшою кількістю опадів навесні та влітку, але розсада ріпаку схильна до стресу від посухи восени та взимку, що серйозно впливає на врожайність. Гірчиця – це особлива олійна культура, яку переважно вирощують у провінції Гуйчжоу. Вона має високу посухостійкість і може вирощуватися в гірських районах. Це багате джерело генів посухостійкості. Відкриття генів посухостійкості має вирішальне значення для покращення сортів гірчиці та інновацій у ресурсах зародкової плазми. Родина GRF відіграє вирішальну роль у рості та розвитку рослин і реакції на стрес від посухи. Наразі гени GRF були виявлені в Arabidopsis 2, рисі (Oryza sativa) 12, ріпаку 13, бавовні (Gossypium hirsutum) 14, пшениці (Triticum aestivum) 15, перловому просі (Setaria italica) 16 та Brassica 17, але немає повідомлень про виявлення генів GRF у гірчиці. У цьому дослідженні гени родини GRF гірчиці були ідентифіковані на рівні всього геному, а також проаналізовані їхні фізичні та хімічні характеристики, еволюційні зв'язки, гомологія, консервативні мотиви, структура генів, дуплікації генів, цис-елементи та стадія проростка (стадія чотирьох листків). Патерни експресії в умовах посухового стресу були всебічно проаналізовані, щоб забезпечити наукову основу для подальших досліджень потенційної функції генів BjGRF у реакції на посуху та знайти гени-кандидати для селекції посухостійкої гірчиці.
Тридцять чотири гени BjGRF були ідентифіковані в геномі Brassica juncea за допомогою двох пошуків HMMER, всі з яких містять домени QLQ та WRC. Послідовності CDS ідентифікованих генів BjGRF представлені в Додатковій таблиці S1. BjGRF01–BjGRF34 названі на основі їхнього розташування на хромосомі. Фізико-хімічні властивості цієї родини вказують на те, що довжина амінокислот дуже мінлива, коливаючись від 261 амінокислот (BjGRF19) до 905 амінокислот (BjGRF28). Ізоелектрична точка BjGRF коливається від 6,19 (BjGRF02) до 9,35 (BjGRF03) із середнім значенням 8,33, а 88,24% BjGRF є основним білком. Прогнозований діапазон молекулярних мас BjGRF становить від 29,82 кДа (BjGRF19) до 102,90 кДа (BjGRF28); Індекс нестабільності білків BjGRF коливається від 51,13 (BjGRF08) до 78,24 (BjGRF19), всі вони перевищують 40, що вказує на те, що індекс жирних кислот коливається від 43,65 (BjGRF01) до 78,78 (BjGRF22), середня гідрофільність (GRAVY) коливається від -1,07 (BjGRF31) до -0,45 (BjGRF22), всі гідрофільні білки BjGRF мають негативні значення GRAVY, що може бути пов'язано з відсутністю гідрофобності, спричиненої залишками. Прогнозування субклітинної локалізації показало, що 31 білок, кодований BjGRF, може бути локалізований у ядрі, BjGRF04 може бути локалізований у пероксисомах, BjGRF25 може бути локалізований у цитоплазмі, а BjGRF28 може бути локалізований у хлоропластах (Таблиця 1), що вказує на те, що BjGRF можуть бути локалізовані в ядрі та відігравати важливу регуляторну роль як фактор транскрипції.
Філогенетичний аналіз родин GRF у різних видів може допомогти у вивченні функцій генів. Тому було завантажено повнорозмірні амінокислотні послідовності 35 GRF ріпаку, 16 GRF ріпи, 12 GRF рису, 10 GRF проса та 9 GRF Arabidopsis, і на основі 34 ідентифікованих генів BjGRF було побудовано філогенетичне дерево (рис. 1). Три підродини містять різну кількість членів; 116 GRF TF поділено на три різні підродини (групи A~C), що містять 59 (50,86%), 34 (29,31%) та 23 (19,83)% GRF відповідно. Серед них 34 члени родини BjGRF розкидані по 3 підродинах: 13 членів у групі A (38,24%), 12 членів у групі B (35,29%) та 9 членів у групі C (26,47%). У процесі поліплоїдизації гірчиці кількість генів BjGRF у різних підродинах різна, і могла відбуватися ампліфікація та втрата генів. Варто зазначити, що в групі C немає розподілу GRF рису та проса, тоді як у групі B є 2 GRF рису та 1 GRF проса, і більшість GRF рису та проса згруповані в одну гілку, що вказує на те, що BjGRF тісно пов'язані з дводольними. Серед них найглибші дослідження функції GRF у Arabidopsis thaliana забезпечують основу для функціональних досліджень BjGRF.
Філогенетичне дерево гірчиці, включаючи Brassica napus, Brassica napus, рис, просо та представників родини Arabidopsis thaliana GRF.
Аналіз повторюваних генів у родині GRF гірчиці. Сіра лінія на задньому плані представляє синхронізований блок у геномі гірчиці, червона лінія представляє пару сегментованих повторів гена BjGRF;
Експресія гена BjGRF за умов посухи на стадії четвертого листка. Дані qRT-PCR наведено в Додатковій таблиці S5. Значні відмінності в даних позначені малими літерами.
Оскільки глобальний клімат продовжує змінюватися, вивчення того, як сільськогосподарські культури справляються зі стресом від посухи та покращення їхніх механізмів стійкості, стало гарячою темою досліджень18. Після посухи морфологічна структура, експресія генів та метаболічні процеси рослин змінюються, що може призвести до припинення фотосинтезу та метаболічних порушень, впливаючи на врожайність та якість сільськогосподарських культур19,20,21. Коли рослини відчувають сигнали посухи, вони виробляють вторинні месенджери, такі як Ca2+ та фосфатидилінозитол, збільшують внутрішньоклітинну концентрацію іонів кальцію та активують регуляторну мережу шляху фосфорилювання білків22,23. Кінцевий цільовий білок безпосередньо бере участь у клітинному захисті або регулює експресію пов'язаних генів стресу через транскрипційні фактори (TF), підвищуючи стійкість рослин до стресу24,25. Таким чином, TF відіграють вирішальну роль у реагуванні на стрес від посухи. Відповідно до послідовності та властивостей зв'язування з ДНК TF, що реагують на стрес від посухи, TF можна розділити на різні родини, такі як GRF, ERF, MYB, WRKY та інші родини26.
Сімейство генів GRF – це тип рослинно-специфічного транскрипційного фактора (TF), який відіграє важливу роль у різних аспектах, таких як ріст, розвиток, передача сигналів та захисні реакції рослин27. З моменту ідентифікації першого гена GRF у O. sativa28, у багатьох видів було ідентифіковано все більше генів GRF, які, як було показано, впливають на ріст, розвиток та реакцію рослин на стрес8, 29, 30, 31, 32. З публікацією послідовності геному Brassica juncea стала можливою ідентифікація сімейства генів BjGRF33. У цьому дослідженні 34 гени BjGRF були ідентифіковані в усьому геномі гірчиці та названі BjGRF01–BjGRF34 на основі їхнього хромосомного положення. Всі вони містять висококонсервативні домени QLQ та WRC. Аналіз фізико-хімічних властивостей показав, що відмінності в кількості амінокислот та молекулярних масах білків BjGRF (за винятком BjGRF28) не були значними, що вказує на те, що члени сімейства BjGRF можуть мати подібні функції. Аналіз структури генів показав, що 64,7% генів BjGRF містили 4 екзони, що свідчить про відносно консервативну структуру гена BjGRF в еволюції, але кількість екзонів у генах BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 та BjGRF29 більша. Дослідження показали, що додавання або видалення екзонів чи інтронів може призвести до відмінностей у структурі та функції генів, тим самим створюючи нові гени34,35,36. Тому ми припускаємо, що інтрон BjGRF був втрачений під час еволюції, що може спричинити зміни у функції гена. Відповідно до існуючих досліджень, ми також виявили, що кількість інтронів була пов'язана з експресією генів. Коли кількість інтронів у гені велика, ген може швидко реагувати на різні несприятливі фактори.
Дуплікація генів є важливим фактором геномної та генетичної еволюції37. Пов'язані дослідження показали, що дуплікація генів не лише збільшує кількість генів GRF, але й служить засобом генерації нових генів, які допомагають рослинам адаптуватися до різних несприятливих умов навколишнього середовища38. У цьому дослідженні було виявлено загалом 48 дублікованих пар генів, усі з яких були сегментальними дуплікаціями, що вказує на те, що сегментальні дуплікації є основним механізмом збільшення кількості генів у цій родині. У літературі повідомлялося, що сегментальна дуплікація може ефективно сприяти ампліфікації членів родини генів GRF у Arabidopsis та суниці, і жодної тандемної дуплікації цієї родини генів не було виявлено у жодного з видів27,39. Результати цього дослідження узгоджуються з існуючими дослідженнями родин Arabidopsis thaliana та суниці, що свідчить про те, що родина GRF може збільшувати кількість генів та генерувати нові гени шляхом сегментальної дуплікації у різних рослин.
У цьому дослідженні в гірчиці було ідентифіковано загалом 34 гени BjGRF, які були розділені на 3 підродини. Ці гени демонстрували подібні консервативні мотиви та генні структури. Аналіз колінеарності виявив 48 пар дуплікацій сегментів у гірчиці. Промоторна область BjGRF містить цис-діючі елементи, пов'язані зі світловою реакцією, гормональною реакцією, реакцією на стрес навколишнього середовища, а також ростом і розвитком. Експресію 34 генів BjGRF було виявлено на стадії проростків гірчиці (коріння, стебла, листя), а також характер експресії 10 генів BjGRF в умовах посухи. Було виявлено, що характер експресії генів BjGRF в умовах стресу посухи був подібним і може бути подібним. Гени BjGRF03 та BjGRF32 можуть відігравати позитивну регуляторну роль при стресі посухи, тоді як BjGRF06 та BjGRF23 відіграють роль у стресі посухи як гени-мішені miR396. Загалом, наше дослідження забезпечує біологічну основу для майбутнього відкриття функції гена BjGRF у рослин Brassicaceae.
Насіння гірчиці, використане в цьому експерименті, було надано Гуйчжоуським науково-дослідним інститутом олійного насіння Гуйчжоуської академії сільськогосподарських наук. Виберіть ціле насіння та висадіть його в ґрунт (субстрат:ґрунт = 3:1), а також зберіть коріння, стебла та листя після стадії чотирьох листків. Рослини обробляли 20% PEG 6000 для імітації посухи, а листя збирали через 0, 3, 6, 12 та 24 години. Всі зразки рослин негайно заморожували в рідкому азоті, а потім зберігали в морозильній камері при температурі -80°C для наступного тесту.
Усі дані, отримані або проаналізовані під час цього дослідження, включені до опублікованої статті та файлів додаткової інформації.
Час публікації: 22 січня 2025 р.