Соснова нематода є карантинним мігруючим ендопаразитом, який, як відомо, спричиняє значні економічні втрати в екосистемах соснових лісів. У цьому дослідженні розглядається нематоцидна активність галогенованих індолів проти соснових нематод та їх механізм дії. Нематоцидна активність 5-йодоіндолу та авермектину (позитивний контроль) проти соснових нематод була подібною та високою при низьких концентраціях (10 мкг/мл). 5-йодоіндол знижує плодючість, репродуктивну активність, смертність ембріонів і личинок, рухову поведінку. Молекулярна взаємодія лігандів із специфічними для безхребетних рецепторами хлоридних каналів із глутаматом підтверджує уявлення про те, що 5-йодоіндол, як і авермектин, міцно зв’язується з активним центром рецептора. 5-Йодоіндол також індукував різні фенотипічні деформації у нематод, включаючи аномальний колапс/усадку органів і посилення вакуолізації. Ці результати свідчать про те, що вакуолі можуть відігравати певну роль у загибелі нематод, опосередкованій метилюванням. Важливо, що 5-йодоіндол був нетоксичним для обох видів рослин (капусти та редьки). Таким чином, це дослідження демонструє, що застосування йодоіндолу в умовах навколишнього середовища може контролювати пошкодження сосни від в’янення.
Соснова нематода (Bursaphelenchus xylophilus) належить до соснових нематод (PWN), мігруючих ендопаразитичних нематод, які, як відомо, завдають серйозної екологічної шкоди екосистемам соснового лісу1. Хвороба в’янення сосни (PWD), спричинена нематодою соснової деревини, стає серйозною проблемою на кількох континентах, включаючи Азію та Європу, а в Північній Америці нематода знищує інтродуковані види сосни1,2. Загибель сосни є серйозною економічною проблемою, і перспектива її глобального поширення викликає тривогу3. Найчастіше нематода вражає такі види сосни: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii та Pinus radiata4. Соснова нематода є серйозною хворобою, яка може вбити сосни протягом декількох тижнів або місяців після зараження. Крім того, спалахи соснової нематоди є поширеними в різних екосистемах, тому встановлено стійкі ланцюги інфекції1.
Bursaphelenchus xylophilus — карантинна рослинно-паразитична нематода, яка належить до надродини Aphelenchoidea та клади 102.5. Нематода харчується грибами та розмножується в деревних тканинах сосен, розвиваючись у чотири різні личинкові стадії: L1, L2, L3, L4 і дорослу особину1,6. В умовах дефіциту їжі соснова нематода переходить у спеціалізовану личинкову стадію – дауеру, яка паразитує на своєму переноснику – сосновому короїді (Monochamus alternatus) і переноситься на здорові сосни. У здорових господарів нематоди швидко мігрують через тканини рослин і харчуються паренхіматозними клітинами, що призводить до ряду реакцій гіперчутливості, в’янення сосни та загибелі протягом року після зараження1,7,8.
Біологічна боротьба з сосновими нематодами вже давно є проблемою, а карантинні заходи ведуться ще в 20 столітті. Сучасні стратегії боротьби з сосновими нематодами передусім включають хімічну обробку, включаючи фумігацію деревини та імплантацію нематоцидів у стовбури дерев. Найбільш часто використовуваними нематоцидами є авермектин і авермектин бензоат, які належать до сімейства авермектинів. Ці дорогі хімікати дуже ефективні проти багатьох видів нематод і вважаються екологічно безпечними9. Однак очікується, що повторне використання цих нематоцидів створить тиск селекції, який майже напевно призведе до появи стійких соснових нематод, як це було продемонстровано для кількох комах-шкідників, таких як Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella та нематод Trichostrongylus colubriformis і Ostertagia circumcincta, які поступово розвинули стійкість до авермектини10,11,12. Тому потрібно регулярно вивчати моделі резистентності та постійно перевіряти нематоциди, щоб знайти альтернативні, економічно ефективні та безпечні для навколишнього середовища заходи для контролю PVD. В останні десятиліття ряд авторів запропонували використовувати рослинні екстракти, ефірні олії та фітонциди як засоби боротьби з нематодами13,14,15,16.
Нещодавно ми продемонстрували нематоцидну активність індолу, міжклітинної та міжкоролівської сигнальної молекули, у Caenorhabditis elegans 17 . Індол є широко поширеним внутрішньоклітинним сигналом у мікробній екології, контролюючи численні функції, які впливають на мікробну фізіологію, утворення спор, стабільність плазмід, стійкість до ліків, утворення біоплівки та вірулентність 18, 19 . Активність індолу та його похідних щодо інших патогенних нематод не досліджена. У цьому дослідженні ми досліджували нематоцидну активність 34 індолів проти соснових нематод і з’ясували механізм дії найпотужнішого 5-йодоіндолу за допомогою мікроскопії, сповільненої фотографії та експериментів з молекулярним докінгом, а також оцінили його токсичну дію на рослини за допомогою аналізу проростання насіння.
Раніше повідомлялося, що високі концентрації (>1,0 мМ) індолу мають нематоцидну дію на нематоди17. Після обробки B. xylophilus (змішані життєві стадії) індолом або 33 різними похідними індолу при 1 мМ смертність B. xylophilus вимірювали шляхом підрахунку живих і мертвих нематод у контрольній і оброблених групах. П'ять індолів виявили значну нематоцидну активність; виживаність контрольної групи без лікування становила 95 ± 7% через 24 год. З 34 тестованих індолів 5-йодоіндол і 4-фторіндол у концентрації 1 мМ викликали 100% смертність, тоді як 5,6-дифторіндиго, метиліндол-7-карбоксилат і 7-йодоіндол спричинили приблизно 50% смертність (табл. 1).
Вплив 5-йодоіндолу на утворення вакуолі та метаболізм соснової деревної нематоди. (A) Вплив авермектину та 5-йодоіндолу на дорослих самців нематод, (B) яйця нематод на стадії L1 та (C) метаболізм B. xylophilus, (i) вакуолі не спостерігалися через 0 годин, лікування призвело до (ii) вакуолей, (iii) накопичення кількох вакуолей, (iv) набряк вакуолей, (v) злиття вакуолей і (vi) утворення гігантських вакуолей. Червоні стрілки вказують на здуття вакуолей, сині стрілки вказують на злиття вакуолей, а чорні стрілки вказують на гігантські вакуолі. Масштабна шкала = 50 мкм.
Крім того, це дослідження також описало послідовний процес індукованої метаном загибелі соснових нематод (рис. 4C). Метаногенна смерть — це неапоптозний тип клітинної смерті, пов’язаний із накопиченням помітних цитоплазматичних вакуолей27. Морфологічні дефекти, які спостерігаються у соснових нематод, здається, тісно пов’язані з механізмом смерті, спричиненої метаном. Мікроскопічне дослідження в різний час показало, що гігантські вакуолі утворюються після 20 годин впливу 5-йодоіндолу (0,1 мМ). Мікроскопічні вакуолі спостерігалися через 8 год обробки, а їх кількість зросла через 12 год. Через 14 годин спостерігали кілька великих вакуолей. Кілька злитих вакуолей було чітко видно через 12–16 годин лікування, що вказує на те, що злиття вакуолей є основою механізму метаногенної смерті. Через 20 годин по всьому хробаку було виявлено кілька гігантських вакуолей. Ці спостереження представляють перше повідомлення про метуоз у C. elegans.
У черв’яків, оброблених 5-йодоіндолом, також спостерігалася агрегація та розрив вакуолі (рис. 5), про що свідчить згинання черв’яка та вихід вакуолі в навколишнє середовище. Порушення вакуолі також спостерігалося в мембрані яєчної шкаралупи, яка зазвичай зберігається недоторканою L2 під час вилуплення (додатковий рис. S2). Ці спостереження підтверджують участь накопичення рідини та недостатності осморегуляції, а також оборотного пошкодження клітин (RCI) у процесі утворення вакуолі та нагноєння (рис. 5).
Висуваючи гіпотезу про роль йоду в спостережуваному утворенні вакуолі, ми досліджували нематоцидну активність йодиду натрію (NaI) і йодиду калію (KI). Однак у концентраціях (0,1, 0,5 або 1 мМ) вони не впливали ні на виживання нематод, ні на утворення вакуолі (додатковий рис. S5), хоча 1 мМ KI мав легкий нематоцидний ефект. З іншого боку, 7-йодоіндол (1 або 2 мМ), як і 5-йодоіндол, викликав численні вакуолі та структурні деформації (додатковий рис. S6). Два йодоіндоли показали подібні фенотипічні характеристики у соснових нематод, тоді як NaI та KI не показали. Цікаво, що індол не індукував утворення вакуолей у B. xylophilus у досліджуваних концентраціях (дані не показані). Таким чином, результати підтвердили, що індол-йодний комплекс відповідає за вакуолізацію та метаболізм B. xylophilus.
Серед індолів, перевірених на нематоцидну активність, 5-йодоіндол мав найвищий індекс ковзання -5,89 ккал/моль, за ним йшли 7-йодоіндол (-4,48 ккал/моль), 4-фторіндол (-4,33) та індол (-4,03) (рис. 6). Сильний водневий зв’язок між 5-йодоіндолом і лейцином 218 стабілізує його зв’язування, тоді як усі інші похідні індолу зв’язуються з серином 260 за допомогою водневих зв’язків бічного ланцюга. Серед інших змодельованих йодоіндолів 2-йодоіндол має значення зв’язування -5,248 ккал/моль, що пов’язано з його основним водневим зв’язком з лейцином 218. Інші відомі зв’язки включають 3-йодоіндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоіндол (-4,0 ккал/моль) і 6-фторіндол (-2,6). ккал/моль) (додатковий малюнок S8). Більшість галогенованих індолів та сам індол, за винятком 5-йодоіндолу та 2-йодоіндолу, утворюють зв’язок із серином 260. Той факт, що водневі зв’язки з лейцином 218 є ознакою ефективного зв’язування рецептора з лігандом, як це спостерігається для івермектину (додатковий рис. S7), підтверджує, що 5-йодоіндол та 2-йодоіндол, як івермектин, міцно зв’язується з активним центром рецептора GluCL через лейцин 218 (рис. 6 і додатковий рис. S8). Ми припускаємо, що це зв’язування необхідне для підтримки відкритої пористої структури комплексу GluCL і що завдяки тісному зв’язуванню з активним центром рецептора GluCL 5-йодоіндол, 2-йодоіндол, авермектин та івермектин таким чином підтримують відкритий іонний канал і дозволяють поглинати рідину.
Молекулярне приєднання індолу та галогенованого індолу до GluCL. Орієнтації зв’язування лігандів (A) індолу, (B) 4-фторіндолу, (C) 7-йоіндолу та (D) 5-йоіндолу з активним центром GluCL. Білок представлений стрічкою, а основні водневі зв’язки показані жовтими пунктирними лініями. (A'), (B'), (C') і (D') показують взаємодії відповідних лігандів із навколишніми амінокислотними залишками, а водневі зв'язки бічного ланцюга позначені рожевими пунктирними стрілками.
Проведено досліди з оцінки токсичної дії 5-йодоіндолу на проростання насіння капусти та редиски. 5-йодоіндол (0,05 або 0,1 мМ) або авермектин (10 мкг/мл) мали незначний вплив або взагалі не впливали на початкове проростання та появу рослин (рис. 7). Крім того, не було виявлено істотної різниці між швидкістю проростання необробленого контролю та насіння, обробленого 5-йодоіндолом або авермектином. Вплив на подовження стрижневого кореня та кількість утворених бічних коренів був незначним, хоча 1 мМ (у 10 разів більше активної концентрації) 5-йодоіндолу трохи затримував розвиток бічних коренів. Ці результати показують, що 5-йодоіндол нетоксичний для клітин рослин і не перешкоджає процесам розвитку рослин у досліджуваних концентраціях.
Вплив 5-йодоіндолу на проростання насіння. Проростання, проростання та бічне укорінення насіння B. oleracea та R. raphanistrum на агаризованому середовищі Мурасіге та Скуга з авермектином або 5-йодоіндолом або без них. Проростання реєстрували через 3 дні інкубації при 22°C.
Це дослідження повідомляє про декілька випадків знищення нематод індолами. Важливо, що це перше повідомлення про метилювання, що викликає йоіндол (процес, викликаний накопиченням маленьких вакуолей, які поступово зливаються у гігантські вакуолі, що зрештою призводить до розриву мембрани та загибелі) у хвої сосни, причому йоіндол демонструє значні нематоцидні властивості, подібні до властивостей комерційного нематоциду авермектину.
Раніше повідомлялося, що індоли виконують численні сигнальні функції в прокаріотах і еукаріотах, включаючи інгібування/утворення біоплівки, виживання бактерій і патогенність19,32,33,34. Останнім часом потенційні терапевтичні ефекти галогенованих індолів, індольних алкалоїдів і напівсинтетичних похідних індолу привернули великий дослідницький інтерес35,36,37. Наприклад, було показано, що галогеновані індоли вбивають стійкі клітини Escherichia coli та Staphylococcus aureus37. Крім того, представляє науковий інтерес вивчення ефективності галогенованих індолів проти інших видів, родів і царств, і це дослідження є кроком до досягнення цієї мети.
Тут ми пропонуємо механізм індукованої 5-йодоіндолом летальності в C. elegans на основі оборотного пошкодження клітин (RCI) і метилювання (рис. 4C і 5). Набрякові зміни, такі як набряк і вакуолярна дегенерація, є показниками RCI та метилювання, що проявляється у вигляді гігантських вакуолей у цитоплазмі48,49. RCI перешкоджає виробництву енергії, зменшуючи виробництво АТФ, викликаючи збій АТФ-азного насоса або руйнуючи клітинні мембрани та спричиняючи швидкий приплив Na+, Ca2+ та води50,51,52. Внутрішньоцитоплазматичні вакуолі виникають у клітинах тварин внаслідок накопичення рідини в цитоплазмі внаслідок надходження Са2+ і води53. Цікаво, що цей механізм пошкодження клітин є оборотним, якщо пошкодження є тимчасовим і клітини починають виробляти АТФ протягом певного періоду часу, але якщо пошкодження зберігається або погіршується, клітини гинуть.54 Наші спостереження показують, що нематоди, оброблені 5-йодоіндолом, не здатні відновити нормальний біосинтез після впливу стресових умов.
Фенотип метилювання, індукований 5-йодоіндолом у B. xylophilus, може бути наслідком наявності йоду та його молекулярного розподілу, оскільки 7-йодоіндол мав менший інгібуючий ефект на B. xylophilus, ніж 5-йодоіндол (таблиця 1 і додатковий малюнок S6). Ці результати частково узгоджуються з дослідженнями Maltese et al. (2014), які повідомили, що транслокація фрагмента піридилового азоту в індолі з пара- в мета-положення скасовує вакуолізацію, пригнічення росту та цитотоксичність у клітинах U251, припускаючи, що взаємодія молекули зі специфічним активним центром у білку є критичною27,44,45. Взаємодії між індоловими або галогенованими індолами та рецепторами GluCL, які спостерігалися в цьому дослідженні, також підтверджують це уявлення, оскільки було виявлено, що 5- та 2-йодоіндол зв’язуються з рецепторами GluCL сильніше, ніж інші досліджені індоли (Малюнок 6 і Додатковий малюнок S8). Було виявлено, що йод у другому або п’ятому положенні індолу зв’язується з лейцином 218 рецептора GluCL за допомогою водневих зв’язків магістралі, тоді як інші галогеновані індоли та сам індол утворюють слабкі водневі зв’язки бічного ланцюга з серином 260 (рис. 6). Тому ми припускаємо, що локалізація галогену відіграє важливу роль в індукції вакуолярної дегенерації, тоді як міцне зв’язування 5-йодоіндолу утримує іонний канал відкритим, тим самим дозволяючи швидкий приплив рідини та розрив вакуолі. Проте детальний механізм дії 5-йодоіндолу ще належить визначити.
Перед практичним застосуванням 5-йодоіндолу необхідно проаналізувати його токсичну дію на рослини. Наші експерименти щодо проростання насіння показали, що 5-йодоіндол не мав негативного впливу на проростання насіння або подальші процеси розвитку в досліджуваних концентраціях (рис. 7). Таким чином, це дослідження створює основу для використання 5-йодоіндолу в екологічному середовищі для контролю шкідливості соснових нематод для соснових дерев.
Попередні звіти продемонстрували, що терапія на основі індолу є потенційним підходом до вирішення проблеми стійкості до антибіотиків і прогресування раку55. Крім того, індоли мають антибактеріальну, протипухлинну, антиоксидантну, протизапальну, протидіабетичну, противірусну, антипроліферативну та протитуберкульозну активність і можуть служити перспективною основою для розробки ліків56,57. Це дослідження вперше свідчить про потенційне використання йоду як протипаразитарного та глистогінного засобу.
Авермектин був відкритий три десятиліття тому і отримав Нобелівську премію в 2015 році, і його використання як глистогінний засіб все ще активно триває. Однак через швидкий розвиток резистентності нематод і комах-шкідників до авермектинів необхідна альтернативна, недорога та екологічно чиста стратегія боротьби з інфекцією сосен. У цьому дослідженні також повідомляється про механізм, за допомогою якого 5-йодоіндол вбиває соснові нематоди, і що 5-йодоіндол має низьку токсичність для клітин рослин, що відкриває хороші перспективи для його майбутнього комерційного застосування.
Усі експерименти були схвалені Комітетом з етики Університету Єннам, Кьонсан, Корея, а методи були виконані відповідно до вказівок Комітету з етики Університету Єннам.
Експерименти з інкубації яєць проводили за встановленими процедурами43. Щоб оцінити швидкість вилуплення (HR), 1-денних дорослих нематод (приблизно 100 самок і 100 самців) переносили в чашки Петрі, що містять гриб, і залишали рости протягом 24 годин. Потім яйця виділяли і обробляли 5-йодоіндолом (0,05 мМ і 0,1 мМ) або авермектином (10 мкг/мл) у вигляді суспензії в стерильній дистильованій воді. Ці суспензії (500 мкл; приблизно 100 яєць) переносили в лунки 24-лункового планшета для культури тканин та інкубували при 22 °C. Підрахунок L2 проводився після 24 годин інкубації, але вважався мертвим, якщо клітини не рухалися під час стимуляції тонким платиновим дротом. Цей експеримент проводився в два етапи, кожний з шістьма повтореннями. Дані обох експериментів були об’єднані та представлені. Відсоток HR розраховується наступним чином:
Смертність личинок оцінювали за попередньо розробленими процедурами. Яйця нематод збирали, а ембріони синхронізували шляхом вилуплення в стерильній дистильованій воді для отримання личинок стадії L2. Синхронізовані личинки (приблизно 500 нематод) обробляли 5-йодоіндолом (0,05 мМ і 0,1 мМ) або авермектином (10 мкг/мл) і вирощували на чашках Петрі з B. cinerea. Після 48 годин інкубації при 22 °C нематоди збирали в стерильну дистильовану воду та досліджували на наявність стадій L2, L3 і L4. Наявність стадій L3 і L4 вказує на личинкову трансформацію, тоді як наявність стадії L2 вказує на відсутність трансформації. Зображення були отримані за допомогою системи iRiS™ Digital Cell Imaging System. Цей експеримент проводився в два етапи, кожний з шістьма повтореннями. Дані обох експериментів були об’єднані та представлені.
Токсичність 5-йодоіндолу та авермектину для насіння оцінювали за допомогою тестів на схожість на чашках з агаром Murashige та Skoog.62 Насіння B. oleracea та R. raphanistrum спочатку замочували в стерильній дистильованій воді на один день, промивали 1 мл 100% етанолу, стерилізували 1 мл 50% комерційного відбілювача (3% гіпохлориту натрію) протягом 15 хв і промивають п'ять разів 1 мл стерильної води. Потім стерилізоване насіння пресували на чашки з агаром для проростання, що містив 0,86 г/л (0,2Х) середовища Мурасіге та Скуга та 0,7% бактеріологічного агару з 5-йодоіндолом або авермектином або без них. Потім планшети інкубували при 22 °C, а зображення робили через 3 дні інкубації. Цей експеримент проводився в два етапи, кожен з яких мав шість повторів.
Час публікації: 26 лютого 2025 р