Соснова нематода – це карантинний мігруючий ендопаразит, відомий тим, що завдає серйозних економічних збитків екосистемам соснових лісів. У цьому дослідженні розглядається нематоцидна активність галогенованих індолів проти соснових нематод та механізм їхньої дії. Нематоцидна активність 5-йодоіндолу та авермектину (позитивний контроль) проти соснових нематод була подібною та високою при низьких концентраціях (10 мкг/мл). 5-йодоіндол знижував плодючість, репродуктивну активність, ембріональну та личинкову смертність, а також рухову поведінку. Молекулярні взаємодії лігандів зі специфічними для безхребетних глутамат-залежними рецепторами хлоридних каналів підтверджують припущення, що 5-йодоіндол, як і авермектин, щільно зв'язується з активним центром рецептора. 5-йодоіндол також індукував різні фенотипічні деформації у нематод, включаючи аномальне колапс/зменшення органів та посилену вакуолізацію. Ці результати свідчать про те, що вакуолі можуть відігравати певну роль у смерті нематод, опосередкованій метилюванням. Важливо, що 5-йодоіндол був нетоксичним для обох видів рослин (капусти та редиски). Таким чином, це дослідження демонструє, що застосування йодоіндолу в умовах навколишнього середовища може контролювати пошкодження сосни в'яненням.
Соснова нематода (Bursaphelenchus xylophilus) належить до соснових деревних нематод (PWN) – мігруючих ендопаразитичних нематод, які, як відомо, завдають серйозної екологічної шкоди екосистемам соснових лісів1. Хвороба в'янення сосни (PWD), спричинена сосновою деревною нематодою, стає серйозною проблемою на кількох континентах, включаючи Азію та Європу, а в Північній Америці нематода знищує інтродуковані види сосни1,2. Знищення популяції сосни є серйозною економічною проблемою, і перспектива її глобального поширення викликає занепокоєння3. Наступні види сосни найчастіше уражаються нематодою: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii та Pinus radiata4. Соснова нематода – це серйозне захворювання, яке може вбити сосни протягом тижнів або місяців після зараження. Крім того, спалахи соснової нематоди є поширеними в різних екосистемах, тому були встановлені стійкі ланцюги інфекції1.
Bursaphelenchus xylophilus – карантинний рослинний паразитичний нематод, що належить до надродини Aphelenchoidea та клади 102.5. Нематода живиться грибами та розмножується в деревних тканинах сосен, розвиваючись до чотирьох різних личинкових стадій: L1, L2, L3, L4 та дорослої особини1,6. В умовах дефіциту їжі сосновий нематод переходить у спеціалізовану личинкову стадію – дауера, яка паразитує на своєму переноснику – сосновому короїді (Monochamus alternatus) та переноситься на здорові сосни. У здорових господарів нематоди швидко мігрують через тканини рослин та живляться паренхіматозними клітинами, що призводить до низки реакцій гіперчутливості, в'янення та загибелі сосни протягом року після зараження1,7,8.
Біологічний контроль соснових нематод вже давно є проблемою, а карантинні заходи сягають 20 століття. Сучасні стратегії боротьби з сосновими нематодами включають переважно хімічну обробку, включаючи фумігацію деревини та імплантацію нематоцидів у стовбури дерев. Найпоширенішими нематоцидами є авермектин та бензоат авермектину, які належать до родини авермектинів. Ці дорогі хімічні речовини є високоефективними проти багатьох видів нематод і вважаються екологічно безпечними9. Однак очікується, що повторне використання цих нематоцидів створить тиск відбору, який майже напевно призведе до появи стійких соснових нематод, як це було продемонстровано для кількох комах-шкідників, таких як Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella та нематод Trichostrongylus colubriformis та Ostertagia circumcincta, які поступово розвинули стійкість до авермектинів10,11,12. Тому необхідно регулярно вивчати моделі стійкості та постійно перевіряти нематоциди, щоб знайти альтернативні, економічно ефективні та екологічно безпечні заходи боротьби з PVD. В останні десятиліття ряд авторів запропонували використовувати рослинні екстракти, ефірні олії та леткі речовини як засоби боротьби з нематодами13,14,15,16.
Нещодавно ми продемонстрували нематоцидну активність індолу, міжклітинної та міжцарської сигнальної молекули, у Caenorhabditis elegans 17. Індол є поширеним внутрішньоклітинним сигналом у мікробній екології, контролюючи численні функції, що впливають на мікробну фізіологію, утворення спор, стабільність плазмід, стійкість до ліків, утворення біоплівки та вірулентність 18, 19. Активність індолу та його похідних проти інших патогенних нематод не вивчалася. У цьому дослідженні ми досліджували нематоцидну активність 34 індолів проти соснових нематод та з'ясували механізм дії найпотужнішого 5-йодоіндолу за допомогою мікроскопії, покадрової фотозйомки та експериментів з молекулярного докінгу, а також оцінили його токсичний вплив на рослини за допомогою аналізу проростання насіння.
Раніше повідомлялося, що високі концентрації (>1,0 мМ) індолу мають нематоцидний ефект на нематод17. Після обробки B. xylophilus (змішані стадії розвитку) індолом або 33 різними похідними індолу в концентрації 1 мМ, смертність B. xylophilus вимірювали шляхом підрахунку живих і мертвих нематод у контрольній та обробленій групах. П'ять індолів продемонстрували значну нематоцидну активність; виживання необробленої контрольної групи становило 95 ± 7% через 24 години. З 34 протестованих індолів 5-йодоіндол та 4-фторіндол в концентрації 1 мМ спричинили 100% смертності, тоді як 5,6-дифторіндиго, метиліндол-7-карбоксилат та 7-йодоіндол спричинили приблизно 50% смертності (Таблиця 1).
Вплив 5-йодоіндолу на формування вакуолей та метаболізм соснової нематоди. (A) Вплив авермектину та 5-йодоіндолу на дорослих самців нематод, (B) яйця нематоди стадії L1 та (C) метаболізм B. xylophilus, (i) вакуолі не спостерігалися через 0 годин, обробка призвела до (ii) вакуолей, (iii) накопичення кількох вакуолей, (iv) набряку вакуолей, (v) злиття вакуолей та (vi) утворення гігантських вакуолей. Червоні стрілки вказують на набряк вакуолей, сині стрілки вказують на злиття вакуолей, а чорні стрілки вказують на гігантські вакуолі. Масштабна шкала = 50 мкм.
Крім того, у цьому дослідженні також описано послідовний процес загибелі, індукованої метаном, у соснових нематод (Рисунок 4C). Метаногенна смерть – це неапоптотичний тип клітинної смерті, пов'язаний з накопиченням помітних цитоплазматичних вакуолей27. Морфологічні дефекти, що спостерігаються у соснових нематод, здається, тісно пов'язані з механізмом загибелі, індукованої метаном. Мікроскопічне дослідження в різний час показало, що гігантські вакуолі утворювалися після 20 годин впливу 5-йодоіндолу (0,1 мМ). Мікроскопічні вакуолі спостерігалися після 8 годин обробки, а їх кількість збільшувалася після 12 годин. Кілька великих вакуолей спостерігалися після 14 годин. Кілька злитих вакуолей були чітко видимі після 12–16 годин обробки, що вказує на те, що злиття вакуолей є основою механізму метаногенної смерті. Через 20 годин по всьому черв'яку було виявлено кілька гігантських вакуолей. Ці спостереження є першим повідомленням про метуоз у C. elegans.
У черв'яків, оброблених 5-йодоіндолом, також спостерігалася агрегація та розрив вакуолей (рис. 5), про що свідчить вигин черв'яка та вивільнення вакуолі в навколишнє середовище. Порушення вакуолі також спостерігалося в мембрані яєчної шкаралупи, яка зазвичай зберігається неушкодженою завдяки L2 під час вилуплення (додатковий рис. S2). Ці спостереження підтверджують причетність накопичення рідини та осморегуляторної недостатності, а також оборотного пошкодження клітин (RCI) до процесу утворення та нагноєння вакуолей (рис. 5).
Висловлюючи гіпотезу про роль йоду в спостережуваному утворенні вакуолей, ми досліджували нематоцидну активність йодиду натрію (NaI) та йодиду калію (KI). Однак, у концентраціях (0,1, 0,5 або 1 мМ) вони не впливали ні на виживання нематод, ні на утворення вакуолей (Додатковий рис. S5), хоча 1 мМ KI мав незначний нематоцидний ефект. З іншого боку, 7-йодоіндол (1 або 2 мМ), як і 5-йодоіндол, індукував множинні вакуолі та структурні деформації (Додатковий рис. S6). Два йодоіндоли демонстрували подібні фенотипічні характеристики у соснових нематод, тоді як NaI та KI цього не робили. Цікаво, що індол не індукував утворення вакуолей у B. xylophilus у протестованих концентраціях (дані не показані). Таким чином, результати підтвердили, що індол-йодний комплекс відповідає за вакуолізацію та метаболізм B. xylophilus.
Серед індолів, протестованих на нематоцидну активність, 5-йодоіндол мав найвищий індекс ковзання -5,89 ккал/моль, далі йшли 7-йодоіндол (-4,48 ккал/моль), 4-фторіндол (-4,33) та індол (-4,03) (Рисунок 6). Міцний водневий зв'язок 5-йодоіндолу з лейцином 218 стабілізує його зв'язування, тоді як усі інші похідні індолу зв'язуються з серином 260 через водневі зв'язки бічного ланцюга. Серед інших змодельованих йодоіндолів, 2-йодоіндол має значення зв'язування -5,248 ккал/моль, що зумовлено його основним водневим зв'язком з лейцином 218. Інші відомі зв'язування включають 3-йодоіндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоіндол (-4,0 ккал/моль) та 6-фторіндол (-2,6 ккал/моль) (Додатковий Рисунок S8). Більшість галогенованих індолів та сам індол, за винятком 5-йодоіндолу та 2-йодоіндолу, утворюють зв'язок із серином 260. Той факт, що водневий зв'язок з лейцином 218 свідчить про ефективне зв'язування рецептор-ліганд, як це спостерігається для івермектину (Додатковий рис. S7), підтверджує, що 5-йодоіндол та 2-йодоіндол, як і івермектин, щільно зв'язуються з активним центром рецептора GluCL через лейцин 218 (Рис. 6 та Додатковий рис. S8). Ми припускаємо, що це зв'язування необхідне для підтримки відкритої пористої структури комплексу GluCL, і що, щільно зв'язуючись з активним центром рецептора GluCL, 5-йодоіндол, 2-йодоіндол, авермектин та івермектин таким чином підтримують іонний канал відкритим та дозволяють поглинати рідину.
Молекулярне з'єднання індолу та галогенованого індолу з GluCL. Орієнтація зв'язування лігандів (A) індолу, (B) 4-фторіндолу, (C) 7-йодоіндолу та (D) 5-йодоіндолу з активним центром GluCL. Білок представлений стрічкою, а водневі зв'язки в остові показані жовтими пунктирними лініями. (A′), (B′), (C′) та (D′) показують взаємодії відповідних лігандів з навколишніми амінокислотними залишками, а водневі зв'язки бічного ланцюга позначені рожевими пунктирними стрілками.
Були проведені експерименти для оцінки токсичного впливу 5-йодоіндолу на проростання насіння капусти та редиски. 5-йодоіндол (0,05 або 0,1 мМ) або авермектин (10 мкг/мл) мали незначний вплив або взагалі не впливали на початкове проростання та появу рослин (Рисунок 7). Крім того, не було виявлено суттєвої різниці між швидкістю проростання необробленого контролю та насіння, обробленого 5-йодоіндолом або авермектином. Вплив на подовження стрижневого кореня та кількість утворених бічних коренів був незначним, хоча 1 мМ (у 10 разів більше його активної концентрації) 5-йодоіндолу дещо затримував розвиток бічних коренів. Ці результати свідчать про те, що 5-йодоіндол нетоксичний для рослинних клітин і не перешкоджає процесам розвитку рослин у досліджуваних концентраціях.
Вплив 5-йодоіндолу на проростання насіння. Проростання, паростання та бічне вкорінення насіння B. oleracea та R. raphanistrum на агаровому середовищі Мурасіге та Скуга з авермектином або 5-йодоіндолом або без них. Проростання реєстрували через 3 дні інкубації при температурі 22°C.
У цьому дослідженні повідомляється про кілька випадків знищення нематод індолами. Важливо, що це перше повідомлення про те, що йодоіндол індукує метилювання (процес, спричинений накопиченням дрібних вакуолей, які поступово зливаються в гігантські вакуолі, що зрештою призводить до розриву мембрани та її загибелі) у хвої сосни, причому йодоіндол проявляє значні нематоцидні властивості, подібні до властивостей комерційного нематоциду авермектину.
Раніше повідомлялося, що індоли виконують численні сигнальні функції у прокаріотів та еукаріотів, включаючи пригнічення/утворення біоплівки, виживання бактерій та патогенність19,32,33,34. Нещодавно потенційні терапевтичні ефекти галогенованих індолів, індольних алкалоїдів та напівсинтетичних похідних індолу привернули широкий дослідницький інтерес35,36,37. Наприклад, було показано, що галогеновані індоли знищують персистуючі клітини Escherichia coli та Staphylococcus aureus37. Крім того, науковий інтерес представляє вивчення ефективності галогенованих індолів проти інших видів, родів та царств, і це дослідження є кроком до досягнення цієї мети.
Тут ми пропонуємо механізм летальності, індукованої 5-йодоіндолом, у C. elegans, заснований на оборотному пошкодженні клітин (RCI) та метилюванні (рисунки 4C та 5). Набрякові зміни, такі як набряк та вакуолярна дегенерація, є показниками RCI та метилювання, що проявляються у вигляді гігантських вакуолей у цитоплазмі48,49. RCI перешкоджає виробленню енергії, зменшуючи вироблення АТФ, викликаючи збій АТФазного насоса або порушуючи клітинні мембрани та спричиняючи швидкий приплив Na+, Ca2+ та води50,51,52. Внутрішньоцитоплазматичні вакуолі виникають у клітинах тварин в результаті накопичення рідини в цитоплазмі через приплив Ca2+ та води53. Цікаво, що цей механізм пошкодження клітин є оборотним, якщо пошкодження тимчасове, і клітини починають виробляти АТФ протягом певного періоду часу, але якщо пошкодження зберігається або посилюється, клітини гинуть.54 Наші спостереження показують, що нематоди, оброблені 5-йодоіндолом, не здатні відновити нормальний біосинтез після впливу стресових умов.
Фенотип метилювання, індукований 5-йодоіндолом у B. xylophilus, може бути зумовлений наявністю йоду та його молекулярним розподілом, оскільки 7-йодоіндол мав менший інгібуючий вплив на B. xylophilus, ніж 5-йодоіндол (Таблиця 1 та Додатковий Рисунок S6). Ці результати частково узгоджуються з дослідженнями Мальтеза та ін. (2014), які повідомили, що транслокація піридильного азотного фрагмента в індолі з пара- в мета-положення скасовує вакуолізацію, пригнічення росту та цитотоксичність у клітинах U251, що свідчить про те, що взаємодія молекули зі специфічним активним центром у білку є критичною27,44,45. Взаємодії між індолом або галогенованими індолами та рецепторами GluCL, що спостерігалися в цьому дослідженні, також підтверджують це припущення, оскільки було виявлено, що 5- та 2-йодоіндол зв'язуються з рецепторами GluCL сильніше, ніж інші досліджені індоли (Рисунок 6 та Додатковий Рисунок S8). Було виявлено, що йод у другому або п'ятому положенні індолу зв'язується з лейцином 218 рецептора GluCL через водневі зв'язки в основі, тоді як інші галогеновані індоли та сам індол утворюють слабкі водневі зв'язки в боковому ланцюгу з серином 260 (Рисунок 6). Тому ми припускаємо, що локалізація галогену відіграє важливу роль в індукції вакуолярної дегенерації, тоді як щільне зв'язування 5-йодоіндолу підтримує іонний канал відкритим, тим самим забезпечуючи швидкий приплив рідини та розрив вакуолі. Однак детальний механізм дії 5-йодоіндолу залишається нез'ясованим.
Перед практичним застосуванням 5-йодоіндолу слід проаналізувати його токсичний вплив на рослини. Наші експерименти з пророщування насіння показали, що 5-йодоіндол не мав негативного впливу на проростання насіння або подальші процеси розвитку у досліджуваних концентраціях (Рисунок 7). Таким чином, це дослідження забезпечує основу для використання 5-йодоіндолу в екологічному середовищі для контролю шкідливості соснових нематод для сосен.
Попередні дослідження показали, що терапія на основі індолу являє собою потенційний підхід до вирішення проблеми стійкості до антибіотиків та прогресування раку55. Крім того, індоли мають антибактеріальну, протиракову, антиоксидантну, протизапальну, протидіабетичну, противірусну, антипроліферативну та протитуберкульозну активність і можуть служити перспективною основою для розробки ліків56,57. Це дослідження вперше пропонує потенційне використання йоду як протипаразитарного та антигельмінтного засобу.
Авермектин був відкритий три десятиліття тому та отримав Нобелівську премію у 2015 році, і його використання як антигельмінтика досі активно триває. Однак, через швидкий розвиток стійкості до авермектинів у нематод та комах-шкідників, необхідна альтернативна, недорога та екологічно чиста стратегія боротьби з інфекцією PWN у сосен. У цьому дослідженні також повідомляється про механізм, за допомогою якого 5-йодоіндол вбиває соснових нематод, і про те, що 5-йодоіндол має низьку токсичність для рослинних клітин, що відкриває хороші перспективи для його майбутнього комерційного застосування.
Усі експерименти були схвалені Етичним комітетом Університету Йоннам, Кьонсан, Корея, а методи були виконані відповідно до рекомендацій Етичного комітету Університету Йоннам.
Експерименти з інкубації яєць проводили за встановленими процедурами43. Для оцінки коефіцієнтів вилуплення (HR) одноденних дорослих нематод (приблизно 100 самок та 100 самців) переносили в чашки Петрі, що містили грибок, і давали їм рости протягом 24 годин. Потім яйця виділяли та обробляли 5-йодоіндолом (0,05 мМ та 0,1 мМ) або авермектином (10 мкг/мл) у вигляді суспензії у стерильній дистильованій воді. Ці суспензії (500 мкл; приблизно 100 яєць) переносили в лунки 24-лункового планшета для культури тканин та інкубували при 22 °C. Підрахунок L2 проводили після 24 годин інкубації, але вважали мертвими, якщо клітини не рухалися при стимуляції тонким платиновим дротом. Цей експеримент проводили у два етапи, кожен з шістьма повтореннями. Дані обох експериментів об'єднували та представляли. Відсоток HR розраховується наступним чином:
Смертність личинок оцінювали за допомогою раніше розроблених процедур. Яйця нематод збирали, а ембріони синхронізували шляхом вилуплення у стерильній дистильованій воді для отримання личинок стадії L2. Синхронізованих личинок (приблизно 500 нематод) обробляли 5-йодоіндолом (0,05 мМ та 0,1 мМ) або авермектином (10 мкг/мл) та вирощували на чашках Петрі з B. cinerea. Після 48 годин інкубації при 22 °C нематод збирали у стерильній дистильованій воді та досліджували на наявність стадій L2, L3 та L4. Наявність стадій L3 та L4 вказувала на личинкову трансформацію, тоді як наявність стадії L2 вказувала на відсутність трансформації. Зображення отримували за допомогою цифрової системи візуалізації клітин iRiS™. Цей експеримент проводили у два етапи, кожен з шістьма повтореннями. Дані обох експериментів об'єднували та представляли.
Токсичність 5-йодоіндолу та авермектину для насіння оцінювали за допомогою тестів на проростання на агарових чашках Мурасіге та Скуга.62 Насіння B. oleracea та R. raphanistrum спочатку замочували у стерильній дистильованій воді протягом одного дня, промивали 1 мл 100% етанолу, стерилізували 1 мл 50% комерційного відбілювача (3% гіпохлориту натрію) протягом 15 хвилин та промивали п'ять разів 1 мл стерильної води. Потім стерилізоване насіння пресували на агарові чашки для пророщування, що містили 0,86 г/л (0,2X) середовища Мурасіге та Скуга та 0,7% бактеріологічного агару з 5-йодоіндолом або авермектином або без них. Потім чашки інкубували при 22 °C, а зображення робили через 3 дні інкубації. Цей експеримент проводили у два етапи, кожен з яких мав шість повторень.
Час публікації: 26 лютого 2025 р.