Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращих результатів рекомендуємо використовувати новішу версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображаємо сайт без стилізації та JavaScript.
Відкриття та корисне використання натуральних продуктів може допомогти покращити життя людини. Хімічні речовини, що пригнічують ріст рослин, широко використовуються як гербіциди для боротьби з бур'янами. Через необхідність використання різних типів гербіцидів існує потреба у виявленні сполук з новими механізмами дії. У цьому дослідженні ми виявили нову N-алкоксипірольну сполуку, кумамонамід, з Streptomyces werraensis MK493-CF1 та встановили повний процес синтезу. За допомогою аналізів біологічної активності ми виявили, що урс-моноамінова кислота є синтетичним проміжним продуктом урс-моноаміду та потенційним...інгібітор росту рослинКрім того, ми розробили різні похідні урбенонової кислоти, включаючи урбенілоксипохідну (УДА), яка має високу гербіцидну активність без негативного впливу на ріст клітин HeLa. Ми також виявили, що похідні урмотонової кислоти порушують мікротрубочки рослин; крім того, KAND впливає на актинові філаменти та індукує загибель клітин; ці багатогранні ефекти відрізняються від ефектів відомих інгібіторів мікротрубочок та свідчать про новий механізм дії урсонової кислоти, що є важливою перевагою в розробці нових гербіцидів.
Відкриття та практичне застосування корисних природних продуктів та їх похідних є засобом покращення якості життя людини. Вторинні метаболіти, що виробляються мікроорганізмами, рослинами та комахами, призвели до значних досягнень у медицині та сільському господарстві. Багато антибіотиків та протилейкемічних препаратів було розроблено з природних продуктів. Крім того, різні видипестицидиЗ цих природних продуктів екстрагують фунгіциди та гербіциди для використання в сільському господарстві. Зокрема, гербіциди для боротьби з бур'янами є важливими інструментами для підвищення врожайності сільськогосподарських культур у сучасному сільському господарстві, і різні типи сполук вже використовуються комерційно. Кілька клітинних процесів у рослинах, такі як фотосинтез, метаболізм амінокислот, синтез клітинної стінки, регуляція мітозу, сигналізація фітогормонів або синтез білка, вважаються типовими мішенями гербіцидів. Сполуки, що пригнічують функцію мікротрубочок, є поширеним класом гербіцидів, які впливають на ріст рослин, впливаючи на мітотичну регуляцію2.
Мікротрубочки є компонентами цитоскелету та широко консервативні в еукаріотичних клітинах. Гетеродимер тубуліну складається з α-тубуліну та β-тубуліну, що утворюють лінійні протофіламенти мікротрубочок, причому 13 протофіламентів утворюють циліндричну структуру. Мікротрубочки відіграють численні ролі в рослинних клітинах, включаючи визначення форми клітин, поділу клітин та внутрішньоклітинного транспорту3,4. Рослинні клітини містять мікротрубочки під інтерфазною плазматичною мембраною, і вважається, що ці так звані кортикальні мікротрубочки контролюють організацію целюлозних мікрофібрил шляхом регуляції комплексів целюлозної синтази4,5. Кортикальні мікротрубочки клітин кореневого епідермісу, присутні в зоні швидкого видовження кінчика кореня, розташовані латерально, а целюлозні мікроволокна слідують за цими мікротрубочками та обмежують напрямок розширення клітин, тим самим сприяючи анізотропному видовженню клітин. Отже, функція мікротрубочок тісно пов'язана з морфологією рослин. Заміщення амінокислот у генах, що кодують тубулін, викликають перекіс масивів кортикальних мікротрубочок та ріст у лівому або правому напрямку у Arabidopsis6,7. Аналогічно, мутації в білках, пов'язаних з мікротрубочками, які регулюють динаміку мікротрубочок, також можуть призвести до спотворення росту коренів8,9,10,11,12,13. Крім того, обробка гербіцидами, що порушують ріст мікротрубочек, такими як дизопірамід, також відомий як претилахлор, також викликає лівобічний косий ріст коренів14. Ці дані вказують на те, що точне регулювання функції мікротрубочок є критичним для визначення напрямку росту рослин.
Було відкрито різні типи інгібіторів мікротрубочок, і ці препарати зробили значний внесок у дослідження цитоскелета, а також у сільське господарство та медицину2. Зокрема, оризалін, динітроанілінові сполуки, дизопірамід, бензамід-споріднені сполуки та їхні аналоги можуть пригнічувати функцію мікротрубочок і тим самим пригнічувати ріст рослин. Тому вони широко використовуються як гербіциди. Однак, оскільки мікротрубочки є важливим компонентом рослинних і тваринних клітин, більшість інгібіторів мікротрубочок є цитотоксичними для обох типів клітин. Тому, незважаючи на їх визнану корисність як гербіцидів, обмежена кількість антимікротрубочкових агентів використовується для практичних цілей.
Streptomyces – це рід родини Streptomyces, до якого входять аеробні, грампозитивні, нитчасті бактерії, і він широко відомий своєю здатністю виробляти широкий спектр вторинних метаболітів. Тому він вважається одним з найважливіших джерел нових біологічно активних природних продуктів. У цьому дослідженні ми виявили нову сполуку під назвою кумамонамід, яка була виділена зі Streptomyces werraensis MK493-CF1 та S. werraensis ISP 5486. За допомогою спектрального аналізу та повного спектрального аналізу було охарактеризовано структуру кумамонаміду та визначено його унікальний N-алкоксипірольний скелет. Було виявлено, що урсмонова кислота, синтетичний проміжний продукт урсмоноаміду та його похідних, пригнічує ріст та проростання популярної модельної рослини Arabidopsis thaliana. У дослідженні взаємозв'язку структура-активність ми виявили, що сполука з C9, модифікованою до урсонової кислоти, яка називається нонілоксипохідною урсонової кислоти (KAND), значно посилює інгібуючий ефект на ріст та проростання. Примітно, що нещодавно відкритий інгібітор росту рослин також впливав на ріст тютюну та печінкової каштани і не був цитотоксичним для бактерій або клітин HeLa. Більше того, деякі похідні урматотонової кислоти викликають спотворений фенотип кореня, що означає, що ці похідні прямо чи опосередковано впливають на мікротрубочки. Відповідно до цієї ідеї, наші спостереження за мікротрубочками, міченими імуногістохімічно або флуоресцентними білками, вказують на те, що обробка KAND деполімеризує мікротрубочки. Крім того, обробка похідними кумамотонової кислоти порушувала актинові мікрофіламенти. Таким чином, ми відкрили новий інгібітор росту рослин, унікальний механізм дії якого включає руйнування цитоскелету.
Штам MK493-CF1 було виділено з ґрунту в районі Сінагава, Токіо. Штам MK493-CF1 утворив добре розгалужений стромальний міцелій. Було визначено часткову послідовність гена 16S рибосомної РНК (1422 п.н.). Цей штам дуже схожий на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 п.н., T: типовий штам, 99,93%). На основі цього результату було встановлено, що цей штам тісно пов'язаний з типовим штамом S. werraensis. Тому ми попередньо назвали цей штам S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T також продукує ті ж біоактивні сполуки. Оскільки ранніх досліджень щодо отримання природних продуктів з цього мікроорганізму було мало, були проведені подальші хімічні дослідження. Після культивування S. werraensis MK493-CF1 на ячмінному середовищі методом твердофазної ферментації при 30°C протягом 14 днів, середовище екстрагували 50% EtOH. 60 мл зразка висушили для отримання 59,5 мг неочищеного екстракту. Неочищений екстракт піддали обернено-фазовій ВЕРХ для отримання N-метокси-1H-пірол-2-карбоксаміду (1, названий кумамонамідом, 36,0 мг). Загальна кількість 1 становить приблизно 60% неочищеного екстракту. Тому ми вирішили детально вивчити властивості кумамотоаміду 1.
Кумамонамід 1 являє собою білий аморфний порошок, і мас-спектрометрія високої роздільної здатності (HRESIMS) підтверджує C6H8N2O2 (рис. 1). C2-заміщений пірольний фрагмент цієї сполуки характеризується δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH у спектрі 1H ЯМР: 4,5 Гц, H-5) та δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр 13C ЯМР показує наявність чотирьох атомів вуглецю sp2. Наявність амідної групи в положенні C2 оцінювали за допомогою кореляції HMBC від протона C-3 до карбонільного вуглецю аміду при δC 161,1. Крім того, піки 1H та 13C ЯМР при δH 4,10 (3H, S) та δC 68,3 вказують на наявність N-метоксигруп у молекулі. Хоча правильне положення метоксигрупи ще не було визначено за допомогою спектроскопічного аналізу, такого як посилена диференціальна спектроскопія та ядерна абревіатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пірол-2-карбоксамід став першою сполукою-кандидатом.
Для визначення правильної структури 1 було проведено повний синтез (рис. 2a). Обробка комерційно доступного 2-амінопіридину 2 m-CPBA призвела до отримання відповідного N-оксиду 3 з кількісним виходом. Після 2-аміноазидування 2, реакцію циклоконденсації, описану Абрамовичем, було проведено в бензолі при 90°C для отримання бажаного 1-гідрокси-1H-пірол-2-карбонітрилу 5 у грамах. Швидкість 60% (два етапи). 15,16. Метилювання та гідроліз 4 потім дали 1-метокси-1H-пірол-2-карбонову кислоту (так звану «кумотонову кислоту», 6) з хорошим виходом (70%, два етапи). Нарешті, амідування через проміжний хлорангидрид 6 з використанням водного розчину аміаку дало амід Кумамото 1 з виходом 98%. Всі спектральні дані синтезованого 1 були подібними до виділеного 1, тому було визначено структуру 1;
Загальний синтез та аналіз біологічної активності урбенаміду та урбенової кислоти. (a) Повний синтез аміду Кумамото. (b) Семиденні саджанці дикого типу Arabidopsis Columbia (Col) вирощували на чашках Murashige та Skoog (MS), що містили кумамонамід 6 або кумамонамід 1 у зазначених концентраціях. Масштабна шкала = 1 см.
Спочатку ми оцінили біологічну активність урбенаміду та його проміжних продуктів щодо їхньої здатності модулювати ріст рослин. Ми додали різні концентрації урсмонаміду 1 або урсмонової кислоти 6 до середовища MS-агару та культивували розсаду Arabidopsis thaliana на цьому середовищі. Ці аналізи показали, що високі концентрації (500 мкМ) 6 пригнічують ріст коренів (рис. 2b). Далі ми створили різні похідні, замінивши положення N1 6, та провели дослідження взаємозв'язку структура-активність (процес синтезу аналогів описано в Додатковій інформації (SI)). Розсаду Arabidopsis вирощували на середовищі, що містило 50 мкМ похідних урсонової кислоти, та вимірювали довжину коренів, як показано на малюнку. Як показано на рисунках 3a, b та S1, кумамокислоти мають різну довжину лінійних алкоксильних ланцюгів (9, 10, 11, 12 та 13) або великих алкоксильних ланцюгів (15, 16 та 17) у положенні N1. Похідні показали значне пригнічення росту коренів. Крім того, ми виявили, що застосування 200 мкМ 10, 11 або 17 пригнічувало проростання (рис. 3c та S2).
Вивчення взаємозв'язку структура-активність аміду Кумамото та споріднених сполук. (a) Структура та схема синтезу аналогів. (b) Кількісне визначення довжини коренів 7-денних проростків, вирощених на середовищі MS з 50 мкМ похідних кумамонаміду або без них. Зірочки вказують на значні відмінності при контрольній обробці (t-тест, p< 0,05). n>18. Дані наведено у вигляді середнього значення ± стандартне відхилення. nt означає «не протестовано», оскільки понад 50% насіння не проросло. (c) Кількісне визначення швидкості проростання обробленого насіння, інкубованого протягом 7 днів у середовищі MS з 200 мкМ кумамонаміду та споріднених сполук або без них. Зірочки вказують на значні відмінності від контрольної групи (критерій хі-квадрат). n=96.
Цікаво, що додавання алкільних бічних ланцюгів, довших за C9, знижувало інгібуючу активність, що свідчить про те, що сполуки, пов'язані з кумамотоєвою кислотою, потребують бічних ланцюгів певного розміру для прояву своєї біологічної активності.
Оскільки аналіз взаємозв'язку структура-активність показав, що C9 був модифікований до урсонової кислоти, а нонілоксипохідна урсонової кислоти (далі KAND 11) була найефективнішим інгібітором росту рослин, ми провели більш детальну характеристику KAND 11. Обробка Arabidopsis 50 мкМ KAND 11 майже повністю запобігала проростанню, тоді як нижчі концентрації (40, 30, 20 або 10 мкМ) KAND 11 пригнічували ріст коренів дозозалежним чином (рис. 4a, b). Щоб перевірити, чи впливає KAND 11 на життєздатність кореневих меристем, ми дослідили кореневі меристеми, забарвлені йодидом пропідію (PI), та виміряли розмір площі меристеми. Розмір меристеми розсади, вирощеної на середовищі, що містило 25 мкМ KAND-11, становив 151,1 ± 32,5 мкм, тоді як розмір меристеми розсади, вирощеної на контрольному середовищі, що містило ДМСО, становив 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4c, d), що вказує на те, що KAND-11 відновлює клітинну активність. поширення. Коренева меристема. Відповідно до цього, обробка KAND 11 зменшила кількість сигналу маркера поділу клітин CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS у кореневій меристемі (рис. 4e) 17. Ці результати вказують на те, що KAND 11 пригнічує ріст коренів, зменшуючи активність проліферації клітин.
Аналіз інгібуючого впливу похідних урбенонової кислоти (урбенілоксипохідних) на ріст. (a) 7-денні проростки дикого типу Col, вирощені на чашках MS із зазначеними концентраціями KAND 11. Масштабна шкала = 1 см. (b) Кількісне визначення довжини коренів. Літери вказують на суттєві відмінності (тест Тьюкі HSD, p< 0,05). n>16. Дані наведено у вигляді середнього значення ± стандартне відхилення. (c) Конфокальна мікроскопія коренів Col дикого типу, забарвлених йодидом пропідію, вирощених на чашках MS з 25 мкМ KAND 11 або без нього. Білі дужки позначають кореневу меристему. Масштабна шкала = 100 мкм. (d) Кількісне визначення розміру кореневої меристеми (n = від 10 до 11). Статистичні відмінності визначали за допомогою t-критерію (p< 0,05). Стовпчики представляють середній розмір меристеми. (e) Диференціальна інтерференційна контрастна (DIC) мікроскопія кореневої меристеми, що містить конструкцію CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS забарвлення та забарвлення 5-денних саджанців, вирощених на чашках MS з аналізом KAND 25 мкМ або без нього.
Фітотоксичність KAND 11 була додатково протестована з використанням іншої дводольної рослини, тютюну (Nicotiana tabacum), та основного модельного організму наземної рослини, печіночниці (Marchantia polymorpha). Як і у випадку з Arabidopsis, розсада тютюну SR-1, вирощена на середовищі, що містило 25 мкМ KAND 11, дала коротше коріння (рис. 5a). Крім того, 40 з 48 насінин проросли на чашках, що містили 200 мкМ KAND 11, тоді як усі 48 насінин проросли на середовищах, оброблених імітаційно, що вказує на значні вищі концентрації KAND (p< 0,05; хі-тест - квадрат) пригнічував проростання тютюну (рис. 5b). Крім того, концентрація KAND 11, яка пригнічувала ріст бактерій у печіночнику, була подібною до ефективної концентрації в Arabidopsis (рис. 5c). Ці результати вказують на те, що KAND 11 може пригнічувати ріст різноманітних рослин. Потім ми дослідили можливу цитотоксичність сполук, пов'язаних з моноамідами ведмедів, в інших організмах, а саме в клітинах HeLa людини та штамі Escherichia coli DH5α, як представниках вищих тваринних та бактеріальних клітин відповідно. У серії аналізів проліферації клітин ми спостерігали, що кумамонамід 1, кумамонамідова кислота 6 та KAND 11 не впливали на ріст клітин HeLa або E. coli в концентраціях 100 мкМ (рис. 5d,e).
Пригнічення росту KAND 11 у організмів, що не належать до Arabidopsis. (a) Двотижневі саджанці тютюну дикого типу SR-1 вирощували на вертикально розташованих чашках MS, що містили 25 мкМ KAND 11. (b) Двотижневі саджанці тютюну дикого типу SR-1 вирощували на горизонтально розташованих чашках MS, що містили 200 мкМ KAND 11. (c) Двотижневі бруньки печінкової каштани дикого типу Tak-1, вирощені на чашках Gamborg B5 із зазначеними концентраціями KAND 11. Червоні стрілки вказують на спори, які припинили ріст протягом двотижневого інкубаційного періоду. (d) Аналіз проліферації клітин HeLa. Кількість життєздатних клітин вимірювали через фіксовані інтервали часу за допомогою набору для підрахунку клітин 8 (Dojindo). Як контроль, клітини HeLa обробляли 5 мкг/мл актиноміцину D (Act D), який інгібує транскрипцію РНК-полімерази та викликає загибель клітин. Аналізи проводили у трьох повторностях. (e) Аналіз проліферації клітин E. coli. Ріст E. coli аналізували шляхом вимірювання OD600. Як контроль, клітини обробляли 50 мкг/мл ампіциліну (Amp), який пригнічує синтез клітинної стінки бактерій. Аналізи проводили у трьох повторностях.
Щоб розшифрувати механізм дії цитотоксичності, спричиненої сполуками, пов'язаними з урамідом, ми повторно проаналізували похідні урбенової кислоти з помірним інгібуючим ефектом, як показано на малюнку. Як показано на рисунках 2b, 6a, проростки, вирощені на агарових чашках, що містять високі концентрації (200 мкМ) урмотонової кислоти 6, утворювали коротші та загнуті вліво корені (θ = –23,7 ± 6,1), тоді як проростки, вирощені на контрольному середовищі, утворювали майже прямі корені (θ = –3,8 ± 7,1). Відомо, що цей характерний косий ріст є результатом дисфункції кортикальних мікротрубочок14,18. Відповідно до цього висновку, препарати, що дестабілізують мікротрубочки, дизопірамід та оризалін, індукували подібний нахил коренів за наших умов росту (рис. 2b, 6a). Водночас ми протестували похідні урмотонової кислоти та відібрали кілька з них, які за певних концентрацій індукували косий ріст коренів. Сполуки 8, 9 та 15 змінювали напрямок росту коренів при 75 мкМ, 50 мкМ та 40 мкМ відповідно, що вказує на те, що ці сполуки можуть ефективно дестабілізувати мікротрубочки (рис. 2b, 6a). Ми також протестували найпотужніший похідний урсолової кислоти, KAND 11, у нижчій концентрації (15 мкМ) та виявили, що застосування KAND 11 пригнічувало ріст коренів, а напрямок росту коренів був нерівномірним, хоча вони мали тенденцію до нахилу ліворуч (рис. C3). Оскільки вищі концентрації препаратів, що дестабілізують мікротрубочки, іноді пригнічують ріст рослин, а не викликають нахил коренів, ми згодом оцінили можливість того, що KAND 11 впливає на мікротрубочки, спостерігаючи кортикальні мікротрубочки в епідермальних клітинах коренів. Імуногістохімія з використанням антитіл до β-тубуліну в епідермальних клітинах коренів розсади, оброблених 25 мкМ KAND 11, показала зникнення майже всіх кортикальних мікротрубочок в епідермальних клітинах в зоні подовження (рис. 6b). Ці результати вказують на те, що кумамотонова кислота та її похідні діють прямо або опосередковано на мікротрубочки, порушуючи їхню роботу, і що ці сполуки є новими інгібіторами мікротрубочок.
Урсонова кислота та її похідні змінюють кортикальні мікротрубочки в Arabidopsis thaliana. (a) Кут нахилу кореня, виміряний у присутності різних похідних урмотонової кислоти у зазначених концентраціях. Також було проаналізовано вплив двох сполук, які, як відомо, пригнічують мікротрубочки: дизопіраміду та оризаліну. На вставці показано стандарт, який використовувався для вимірювання кута росту кореня. Зірочки вказують на значні відмінності з контрольною групою (t-тест, p< 0,05). n>19. Масштабна шкала = 1 см. (b) Кортикальні мікротрубочки в епідермальних клітинах у зоні елонгації. Мікротрубочки в коренях Arabidopsis Col дикого типу, вирощених на чашках MS з 25 мкМ KAND 11 або без нього, візуалізували за допомогою імуногістохімічного фарбування з використанням первинних антитіл до β-тубуліну та вторинних антитіл, кон'югованих з Alexa Fluor. Масштабна шкала = 10 мкм. (c) Мітотична структура мікротрубочок у меристемі кореня. Мікротрубочки візуалізували за допомогою імуногістохімічного фарбування. Мітотичні структури, включаючи профазні зони, веретена делікції та фрагмопласти, підраховували за конфокальними зображеннями. Стрілки вказують на мітотичні структури мікротрубочок. Зірочки вказують на значні відмінності з фіктивною обробкою (t-тест, p< 0,05). n>9. Масштабна шкала = 50 мкм.
Хоча Ursa має здатність порушувати функцію мікротрубочок, очікується, що механізм її дії відрізнятиметься від типових агентів, що деполімеризують мікротрубочки. Наприклад, вищі концентрації агентів, що деполімеризують мікротрубочки, таких як дизопірамід та оризалін, індукують анізотропне розширення епідермальних клітин, тоді як KAND 11 цього не робить. Крім того, спільне застосування KAND 11 та дизопіраміду призвело до комбінованої дизопірамідом індукованої відповіді росту коренів, а також спостерігалося пригнічення росту, індуковане KAND 11 (рис. S4). Ми також проаналізували реакцію гіперчутливого мутанта дизопіраміду 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 має неканонічну точкову мутацію тубулінкінази та утворює коротше коріння при обробці дизопірамідом9,20. Проростки мутанта phs1-1, вирощені на агаровому середовищі, що містить KAND 11, мали коротше коріння, подібне до тих, що вирощені на дизопіраміді (рис. S5).
Крім того, ми спостерігали мітотичні структури мікротрубочок, такі як профазні зони, веретена делення та фрагмопласти, у кореневій меристемі розсади, обробленої KAND 11. Відповідно до спостережень для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, спостерігалося значне зменшення кількості мітотичних мікротрубочок (рис. .6c).
Щоб охарактеризувати цитотоксичність KAND 11 при субклітинному розділенні, ми обробили суспензійні клітини тютюну BY-2 за допомогою KAND 11 та спостерігали за їхньою реакцією. Спочатку ми додали KAND 11 до клітин BY-2, що експресують TagRFP-TUA6, який флуоресцентно мічає мікротрубочки, щоб оцінити вплив KAND 11 на кортикальні мікротрубочки. Щільність кортикальних мікротрубочок оцінювали за допомогою аналізу зображень, який кількісно визначав відсоток пікселів цитоскелета серед цитоплазматичних пікселів. Результати аналізу показали, що після обробки 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 протягом 1 години щільність значно знизилася до 0,94 ± 0,74% або 0,23 ± 0,28% відповідно, тоді як щільність клітин, оброблених ДМСО, становила 1,61 ± 0,34% (рис. 7a). Ці результати узгоджуються зі спостереженням у Arabidopsis, що обробка KAND 11 індукує деполімеризацію кортикальних мікротрубочок (рис. 6b). Ми також дослідили лінію BY-2 з актиновими філаментами, міченими GFP-ABD, після обробки такою ж концентрацією KAND 11 і спостерігали, що обробка KAND 11 порушила актинові філаменти. Обробка 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 протягом 1 години значно знизила щільність актинових філаментів до 1,20 ± 0,62% або 0,61 ± 0,26% відповідно, тоді як щільність у клітинах, оброблених DMSO, становила 1,69 ± 0,51% (рис. 2). 7b). Ці результати контрастують з ефектами пропізмаміду, який не впливає на актинові філаменти, та латрункуліну B, деполімеризатора актину, який не впливає на мікротрубочки (рис. S6 доповненої інформації). Крім того, обробка кумамонамідом 1, кумамонамідною кислотою 6 або KAND 11 не впливала на мікротрубочки в клітинах HeLa (рис. S7 доповненої інформації). Таким чином, вважається, що механізм дії KAND 11 відрізняється від механізму відомих руйнівників цитоскелету. Крім того, наше мікроскопічне спостереження клітин BY-2, оброблених KAND 11, виявило початок клітинної загибелі під час обробки KAND 11 і показало, що частка мертвих клітин, забарвлених синім Еванса, суттєво не збільшилася після 30 хвилин обробки KAND 11, тоді як після 90 хвилин обробки 50 мкМ або 100 мкМ KAND кількість мертвих клітин збільшилася до 43,7% або 80,1% відповідно (рис. 7c). У сукупності ці дані вказують на те, що новий похідний урсолової кислоти KAND 11 є рослинно-специфічним інгібітором цитоскелету з раніше невідомим механізмом дії.
KAND впливає на кортикальні мікротрубочки, актинові філаменти та життєздатність клітин тютюну BY-2. (a) Візуалізація кортикальних мікротрубочок у клітинах BY-2 у присутності TagRFP-TUA6. Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або DMSO, досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії. Щільність кортикальних мікротрубочок розраховували за мікрофотографіями 25 незалежних клітин. Літери вказують на значні відмінності (тест Тьюкі HSD, p< 0,05). Масштабна шкала = 10 мкм. (b) Кортикальні актинові філаменти в клітинах BY-2, візуалізовані у присутності GFP-ABD2. Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або DMSO, досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії. Щільність кортикальних актинових філаментів розраховували за мікрофотографіями 25 незалежних клітин. Літери позначають суттєві відмінності (тест Тьюкі HSD, p< 0,05). Масштабна шкала = 10 мкм. (c) Спостереження загиблих клітин BY-2 за допомогою фарбування синім Еванса. Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або DMSO, досліджували за допомогою світлопольної мікроскопії. n=3. Масштабна шкала = 100 мкм.
Відкриття та застосування нових природних продуктів призвело до значного прогресу в різних аспектах людського життя, включаючи медицину та сільське господарство. Були проведені історичні дослідження для отримання корисних сполук з природних ресурсів. Зокрема, актиноміцети відомі своєю корисністю як протипаразитарні антибіотики проти нематод завдяки своїй здатності виробляти різні вторинні метаболіти, такі як авермектин, провідна сполука івермектину, та блеоміцин та його похідні, що використовуються в медицині як протираковий засіб21,22. Аналогічно, з актиноміцетів було виявлено різноманітні гербіцидні сполуки, деякі з яких вже використовуються комерційно1,23. Тому аналіз метаболітів актиноміцетів для виділення природних продуктів з бажаною біологічною активністю вважається ефективною стратегією. У цьому дослідженні ми виявили нову сполуку, кумамонамід, з S. werraensis та успішно синтезували її. Урсонова кислота є синтетичним проміжним продуктом урбенаміду та його похідних. Вона може викликати характерне скручування коренів, проявляти помірну або сильну гербіцидну активність та прямо чи опосередковано пошкоджувати мікротрубочки рослин. Однак механізм дії урмотонової кислоти може відрізнятися від механізму дії існуючих інгібіторів мікротрубочок, оскільки KAND 11 також порушує актинові філаменти та викликає загибель клітин, що свідчить про регуляторний механізм, за допомогою якого урмотонова кислота та її похідні впливають на широкий спектр структур цитоскелета.
Подальша детальна характеристика урбенонової кислоти допоможе краще зрозуміти механізм її дії. Зокрема, наступною метою є оцінка здатності урсонової кислоти зв'язуватися з відновленими мікротрубочками, щоб визначити, чи діє урсонова кислота та її похідні безпосередньо на мікротрубочки та деполімеризує їх, чи їхня дія призводить до дестабілізації мікротрубочок. Крім того, у випадку, коли мікротрубочки не є прямою мішенню, визначення місця дії та молекулярних мішеней урсонової кислоти на рослинних клітинах допоможе краще зрозуміти властивості споріднених сполук та можливі шляхи покращення гербіцидної активності. Наш аналіз біоактивності виявив унікальну цитотоксичну здатність урсонової кислоти щодо росту таких рослин, як Arabidopsis thaliana, тютюн та печінкова каштанка, тоді як ні клітини E. coli, ні клітини HeLa не постраждали. Незначна або відсутня токсичність для клітин тварин є перевагою похідних урсонової кислоти, якщо вони розробляються як гербіциди для використання на відкритих сільськогосподарських полях. Дійсно, оскільки мікротрубочки є поширеними структурами у еукаріотів, їх селективне інгібування в рослинах є ключовою вимогою до гербіцидів. Наприклад, пропізмід, агент деполімеризації мікротрубочок, який безпосередньо зв'язується з тубуліном та інгібує полімеризацію, використовується як гербіцид завдяки своїй низькій токсичності для клітин тварин24. На відміну від дизопіраміду, споріднені бензаміди мають різну специфічність дії на мішень. Окрім рослинних мікротрубочок, RH-4032 або бензоксамід також інгібує мікротрубочки клітин тварин або ооміцетів відповідно, а заліламід використовується як фунгіцид завдяки своїй низькій фітотоксичності25,26,27. Нещодавно виявлений ведмідь та його похідні проявляють селективну цитотоксичність проти рослин, але варто зазначити, що подальші модифікації можуть змінити їхню специфічність дії на мішень, потенційно забезпечуючи додаткові похідні для контролю патогенних грибів або ооміцетів.
Унікальні властивості урбенонової кислоти та її похідних корисні для їх розробки як гербіцидів та використання як дослідницьких інструментів. Важливість цитоскелету в контролі форми рослинних клітин широко визнана. Попередні дослідження показали, що рослини розвинули складні механізми організації кортикальних мікротрубочок, контролюючи динаміку мікротрубочок для належного контролю морфогенезу. Було виявлено велику кількість молекул, відповідальних за регуляцію активності мікротрубочок, і відповідні дослідження все ще тривають3,4,28. Наше сучасне розуміння динаміки мікротрубочок у рослинних клітинах не повністю пояснює механізми організації кортикальних мікротрубочок. Наприклад, хоча як дизопірамід, так і оризалін можуть деполімеризувати мікротрубочки, дизопірамід викликає сильне деформування коренів, тоді як оризалін має відносно м'який ефект. Більше того, мутації в тубуліні, який стабілізує мікротрубочки, також викликають декстроротацію коренів, тоді як паклітаксел, який також стабілізує динаміку мікротрубочок, цього не робить. Тому вивчення та ідентифікація молекулярних мішеней урсолової кислоти має дати нове розуміння регуляції кортикальних мікротрубочок рослин. Так само, майбутні порівняння хімічних речовин, ефективних у сприянні спотвореному росту, таких як дизопірамід, та менш ефективних хімічних речовин, таких як оризалін або кумамоторна кислота, дадуть підказки щодо того, як відбувається спотворений ріст.
З іншого боку, перебудови цитоскелета, пов'язані із захистом, є ще однією можливістю пояснення цитотоксичності урсонової кислоти. Інфікування патогеном або введення еліситора в клітини рослин іноді призводить до руйнування цитоскелету та подальшої загибелі клітин29. Наприклад, повідомлялося, що криптоксантин, отриманий з ооміцетів, порушує мікротрубочки та актинові філаменти перед загибеллю клітин тютюну, подібно до того, що відбувається при обробці KAND30,31. Подібність між захисними реакціями та клітинними реакціями, індукованими урсоновою кислотою, призвела нас до гіпотези, що вони запускають загальні клітинні процеси, хоча очевидний швидший та сильніший ефект урсонової кислоти, ніж криптоксантину. Однак дослідження показали, що порушення актинових філаментів сприяє спонтанній загибелі клітин, яка не завжди супроводжується порушенням мікротрубочок29. Крім того, ще належить з'ясувати, чи викликає патоген, чи еліситор спотворений ріст коренів, як це роблять похідні урсонової кислоти. Таким чином, молекулярні знання, що пов'язують захисні реакції та цитоскелет, є привабливою проблемою, яку потрібно вирішити. Використовуючи наявність низькомолекулярних сполук, пов'язаних з урсоновою кислотою, а також низку похідних з різною активністю, вони можуть надати можливості для впливу на невідомі клітинні механізми.
У сукупності, відкриття та застосування нових сполук, що модулюють динаміку мікротрубочок, забезпечать потужні методи для вивчення складних молекулярних механізмів, що лежать в основі визначення форми рослинних клітин. У цьому контексті нещодавно розроблена сполука урматонова кислота, яка впливає на мікротрубочки та актинові філаменти та індукує загибель клітин, може дати можливість розшифрувати зв'язок між контролем мікротрубочок та цими іншими механізмами. Таким чином, хімічний та біологічний аналіз з використанням урбенонової кислоти допоможе нам зрозуміти молекулярні регуляторні механізми, що контролюють цитоскелет рослин.
Інокулюйте S. werraensis MK493-CF1 у колбу Ерленмейєра об'ємом 500 мл з перегородкою, що містить 110 мл посівного середовища, що складається з 2% (мас./об.) галактози, 2% (мас./об.) пасти есенції, 1% (мас./об.) складу Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (мас./об.) екстракту кукурудзи (KOGOSTCH Co., Ltd., Японія), 0,2% (мас./об.) (NH4)2SO4 та 0,2% CaCO3 у деіонізованій воді (pH 7,4 перед стерилізацією). Посівні культури інкубували на роторному шейкері (180 об/хв) при 27°C протягом 2 днів. Виробниче культивування методом твердофазної ферментації. Посівну культуру (7 мл) перенесли в колбу K-1 об'ємом 500 мл, що містила 40 г виробничого середовища, що складалося з 15 г пресованого ячменю (MUSO Co., Ltd., Японія) та 25 г деіонізованої води (pH не регулювали перед стерилізацією). Ферментацію проводили при 30°C у темряві протягом 14 днів. Ферментаційний матеріал екстрагували 40 мл/пляшку EtOH та центрифугували (1500 g, 4°C, 10 хв). Супернатант культури (60 мл) екстрагували сумішшю 10% MeOH/EtOAc. Органічний шар випарювали під зниженим тиском з отриманням залишку (59,5 мг), який піддавали ВЕРХ з градієнтним елююванням (0–10 хвилин: 90%) на колонці з оберненою фазою (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, внутрішній діаметр 10 мм × довжина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 хвилин: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градієнт), 35–45 хвилин: 90% H2O/EtOH, 45–155 хвилин: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градієнт (градієнт), 155–200 хв: 100% EtOH) зі швидкістю потоку 1,5 мл/хв, кумамонамід (1, 36,0 мг) виділяли у вигляді білого аморфного порошку.
Кумамотоамід(1); 1H-ЯМР (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Гц, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Гц 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Гц, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-ЯМР (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ розраховане значення: 141,0659, виміряне значення: 141,0663, ІЧ νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Насіння Columbia (Col-0) було отримано з Центру біологічних ресурсів Arabidopsis (ABRC) з дозволом на використання в дослідженнях. Насіння Col-0 було розмножено та вирощено в наших лабораторних умовах і використано як рослини Arabidopsis дикого типу. Насіння Arabidopsis було поверхнево стерилізовано та культивовано в середовищі Murashige та Skoog половинної концентрації, що містило 2% сахарози (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (мас./об.) 2-(4-морфоліно)етансульфонової кислоти (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). та 1,5% агару (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при 23 °C та постійному освітленні. Насіння мутанта phs1-1 було надано Т. Хашімото (Нарський інститут науки і технологій).
Насіння штаму SR-1 було надано Т. Хашимото (Нарський інститут науки і технологій) та використано як рослини тютюну дикого типу. Насіння тютюну стерилізували поверхнево та замочували у стерильній воді протягом трьох ночей для стимулювання проростання, потім поміщали у розчин половинної концентрації, що містив 2% сахарози, 0,05% (мас./об.) MES та 0,8% геланової камеді (середовище Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурасіге та Скуга) з pH 5,7 та інкубували при 23°C за постійного освітлення.
Штам Tak-1 був наданий Т. Кохчі (Кіотський університет) і використовувався як стандартна експериментальна одиниця для дослідження печінкової каштани. Гемму отримували зі стерилізованих культивованих рослин, потім висівали на середовище Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), що містило 1% сахарози та 0,3% геланової камеді, та інкубували при 23°C під безперервним світлом.
Клітини тютюну BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) були надані С. Хаседавою (Токійський університет). Клітини BY-2 розводили в 95 разів у модифікованому середовищі Лінсмайєра та Скуга та щотижня доповнювали 2,4-дихлорфеноксиоцтовою кислотою 32. Суспензію клітин перемішували на роторному шейкері зі швидкістю 130 об/хв при 27°C у темряві. Промивали клітини 10-кратним об'ємом свіжого середовища та ресуспендували в тому ж середовищі. Трансгенні клітинні лінії BY-2, що стабільно експресують маркер мікротрубочок TagRFP-TUA6 або маркер актинових філаментів GFP-ABD2 під промотором вірусу мозаїки цвітної капусти 35S, були отримані, як описано 33, 34, 35. Ці клітинні лінії можна підтримувати та синхронізувати за допомогою процедур, подібних до тих, що використовувалися для оригінальної клітинної лінії BY-2.
Клітини HeLa культивували в модифікованому середовищі Ігла Дульбекко (DMEM) (Life Technologies), доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою, 1,2 Од/мл пеніциліну та 1,2 мкг/мл стрептоміцину в інкубаторі при температурі 37°C з 5% CO2.
Усі експерименти, описані в цьому рукописі, були проведені відповідно до японських правил та рекомендацій щодо біобезпеки.
Сполуки розчиняли в диметилсульфоксиді (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) у вигляді маткових розчинів та розводили в середовищі MS для Arabidopsis та тютюну або середовищі Gamborg B5 для печінкової каштани. Для аналізу пригнічення росту коренів понад 10 насінин на чашку висівали на агарове середовище, що містило зазначені сполуки або DMSO. Насіння інкубували в ростовій камері протягом 7 днів. Саджанці фотографували та вимірювали довжину коренів. Для аналізу проростання Arabidopsis 48 насінин на чашку висівали на агарове середовище, що містило 200 мкМ сполуки або DMSO. Насіння Arabidopsis вирощували в ростовій камері, і кількість пророслих саджанців підраховували через 7 днів після проростання (dag). Для аналізу проростання тютюну 24 насінини на чашку висівали на агарове середовище, що містило 200 мкМ KAND або DMSO. Насіння тютюну вирощували в ростовій камері, і кількість пророслих саджанців підраховували через 14 днів. Для аналізу пригнічення росту печінкової мухи 9 ембріонів з кожної чашки висівали на агарове середовище, що містило зазначені концентрації KAND або DMSO, та інкубували в камері для росту протягом 14 днів.
Для візуалізації організації кореневих меристем використовували проростки, забарвлені 5 мг/мл йодидом пропідію (PI). Сигнали PI спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням конфокального лазерного скануючого мікроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гістохімічне фарбування коренів β-глюкуронідазою (GUS) проводили згідно з протоколом, описаним Маламі та Бенфеєм36. Саджанці фіксували в 90% ацетоні протягом ночі, фарбували 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-d-глюкуронової кислоти в буфері GUS протягом 1 години та поміщали в гідратований розчин хлоральдегіду (8 г хлоралгідрату, 2 мл води та 1 мл гліцерину) та спостерігали за допомогою диференціальної інтерференційної контрастної мікроскопії з використанням мікроскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Кути коренів вимірювали на 7-денних розсадах, вирощених на вертикально розміщених пластинах. Виміряйте кут кореня відносно напрямку вектора сили тяжіння, як описано в кроці 6.
Розташування кортикальних мікротрубочок спостерігали, як описано, з незначними змінами до протоколу 37. Антитіла проти β-тубуліну (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) та кон'юговані з Alexa Fluor 488 антитіла проти мишачого IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) використовували як первинні та вторинні антитіла в розведеннях 1:1000 та 1:100 відповідно. Флуоресцентні зображення отримували за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа TCS SPE (Leica Microsystems). Отримуйте Z-стекові зображення та створюйте проекції максимальної інтенсивності згідно з інструкціями виробника.
Аналіз проліферації клітин HeLa проводили за допомогою набору для підрахунку клітин Cell Counting Kit 8 (Dojindo) згідно з інструкціями виробника.
Ріст E. coli DH5α аналізували, вимірюючи щільність клітин у культурі за допомогою спектрофотометра при 600 нм (OD600).
Організацію цитоскелета в трансгенних клітинах BY-2 спостерігали за допомогою флуоресцентного мікроскопа, оснащеного конфокальним скануючим пристроєм CSU-X1 (Yokogawa) та sCMOS-камерою (Zyla, Andor Technology). Щільність цитоскелета оцінювали за допомогою аналізу зображень, який кількісно визначав відсоток пікселів цитоскелета серед цитоплазматичних пікселів на конфокальних зображеннях за допомогою програмного забезпечення ImageJ, як описано38,39.
Для виявлення загибелі клітин у клітинах BY-2 аліквоту клітинної суспензії інкубували з 0,05% синім Еванса протягом 10 хвилин за кімнатної температури. Селективне забарвлення мертвих клітин синім Еванса залежить від екструзії барвника з життєздатних клітин інтактною плазматичною мембраною40. Забарвлені клітини спостерігали за допомогою світлопольного мікроскопа (BX53, Olympus).
Клітини HeLa вирощували в середовищі DMEM, доповненому 10% FBS, у зволоженому інкубаторі при 37°C та 5% CO2. Клітини обробляли 100 мкМ KAND 11, кумамонамідною кислотою 6, кумамонамідом 1, 100 нг/мл колцеміду (Gibco) або 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) протягом 6 годин при 37°C. Клітини фіксували MetOH протягом 10 хвилин, а потім ацетатом протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Фіксовані клітини інкубували з первинним антитілом до β-тубуліну (1D4A4, Proteintech: 66240-1), розведеним у 0,5% BSA/PBS протягом 2 годин, промивали 3 рази TBST, а потім інкубували з козячим антитілом Alexa Fluor. 488 протягом 1 години. – Мишачий IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) та 15 нг/мл 4′,6-діамідино-2-феніліндолу (DAPI), розведеного у 0,5% BSA/PBS. Після триразового промивання TBST забарвлені клітини спостерігали на інвертованому мікроскопі Nikon Eclipse Ti-E. Зображення отримували за допомогою охолоджуваної CCD-камери Hamamatsu ORCA-R2 з використанням програмного забезпечення MetaMorph (Molecular Devices).
Час публікації: 17 червня 2024 р.