Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для досягнення найкращих результатів ми рекомендуємо вам використовувати новішу версію вашого браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Відкриття та корисне використання натуральних продуктів може допомогти покращити життя людини.Інгібітори росту рослин широко використовуються як гербіциди для боротьби з бур'янами.У зв’язку з необхідністю використання різних типів гербіцидів виникає потреба в ідентифікації сполук з новими механізмами дії.У цьому дослідженні ми виявили нову сполуку N-алкоксипіролу, кумамонамід, із Streptomyces werraensis MK493-CF1 і встановили повний процес синтезу.За допомогою аналізів біологічної активності ми виявили, що урс-моноамінова кислота є синтетичним проміжним продуктом урс-моноаміду та потенційнимінгібітор росту рослин.Крім того, ми розробили різні похідні урбенонової кислоти, включаючи похідне урбенілокси (UDA), яке має високу гербіцидну активність без негативного впливу на ріст клітин HeLa.Ми також виявили, що похідні урмотонової кислоти порушують мікротрубочки рослин;крім того, KAND впливає на нитки актину та індукує загибель клітин;Ці багатогранні ефекти відрізняються від відомих інгібіторів мікротрубочок і пропонують новий механізм дії урсонової кислоти, що є важливою перевагою при розробці нових гербіцидів.
Відкриття та практичне застосування корисних природних продуктів та їх похідних є засобом покращення якості життя людини.Вторинні метаболіти, що виробляються мікроорганізмами, рослинами та комахами, привели до значного прогресу в медицині та сільському господарстві.Багато антибіотиків і ліків від лейкемії були розроблені з натуральних продуктів.Крім того, різні видипестициди, фунгіциди та гербіциди витягуються з цих природних продуктів для використання в сільському господарстві.Зокрема, гербіциди для боротьби з бур'янами є важливими інструментами для підвищення врожайності сільськогосподарських культур у сучасному сільському господарстві, і різні типи сполук вже використовуються в комерційних цілях.Деякі клітинні процеси в рослинах, такі як фотосинтез, метаболізм амінокислот, синтез клітинної стінки, регуляція мітозу, передача сигналів фітогормонів або синтез білка, вважаються типовими мішенями для гербіцидів.Сполуки, які пригнічують функцію мікротрубочок, є звичайним класом гербіцидів, які впливають на ріст рослин шляхом впливу на регуляцію мітозу2.
Мікротрубочки є компонентами цитоскелета і широко збережені в еукаріотичних клітинах.Гетеродимер тубуліну складається з α-тубуліну та β-тубуліну, які утворюють лінійні протофіламенти мікротрубочок, з 13 протофіламентами, які утворюють циліндричну структуру.Мікротрубочки відіграють багато ролей у рослинних клітинах, включаючи визначення форми клітини, поділ клітини та внутрішньоклітинний транспорт3,4.Рослинні клітини містять мікротрубочки під інтерфазною плазматичною мембраною, і вважається, що ці так звані кортикальні мікротрубочки контролюють організацію целюлозних мікрофібрил через регуляцію целюлозосинтазних комплексів4,5.Кортикальні мікротрубочки клітин кореневого епідермісу, присутні в зоні швидкого подовження верхівки кореня, розташовані латерально, а целюлозні мікроволокна слідують за цими мікротрубочками та обмежують напрямок розширення клітин, тим самим сприяючи анізотропному подовженню клітин.Тому функція мікротрубочок тісно пов’язана з морфологією рослин.Амінокислотні заміни в генах, що кодують тубулін, спричиняють викривлення масивів кортикальних мікротрубочок і ліво- або правобічний ріст у Arabidopsis 6,7.Подібним чином мутації в білках, асоційованих з мікротрубочками, які регулюють динаміку мікротрубочок, також можуть призвести до спотвореного росту кореня8,9,10,11,12,13.Крім того, обробка гербіцидами, що руйнують мікротрубочки, такими як дизопірамід, також відомий як претілахлор, також спричиняє лівосторонній косий ріст коренів14.Ці дані вказують на те, що точне регулювання функції мікротрубочок має вирішальне значення для визначення напрямку росту рослин.
Було відкрито різні типи інгібіторів мікротрубочок, і ці препарати зробили значний внесок у дослідження цитоскелету, а також у сільське господарство та медицину2.Зокрема, оризалін, динітроанілінові сполуки, дизопірамід, бензамідні сполуки та їх аналоги можуть пригнічувати функцію мікротрубочок і тим самим пригнічувати ріст рослин.Тому їх широко використовують як гербіциди.Однак, оскільки мікротрубочки є важливим компонентом клітин рослин і тварин, більшість інгібіторів мікротрубочок є цитотоксичними для обох типів клітин.Таким чином, незважаючи на їх визнану корисність як гербіцидів, обмежена кількість засобів проти мікротрубочок використовується для практичних цілей.
Streptomyces — рід сімейства Streptomyces, який включає аеробні, грампозитивні, ниткоподібні бактерії та широко відомий своєю здатністю продукувати широкий спектр вторинних метаболітів.Тому він вважається одним із найважливіших джерел нових біологічно активних природних продуктів.У поточному дослідженні ми виявили нову сполуку під назвою кумамонамід, яку було виділено з Streptomyces werraensis MK493-CF1 і S. werraensis ISP 5486. За допомогою спектрального аналізу та повного спектрального аналізу було охарактеризовано структуру кумамонаміду та його унікальний N-алкоксипіррольний скелет. було визначено.синтез.Було виявлено, що урмонова кислота, синтетичний проміжний продукт урсмоноаміду та його похідних, пригнічує ріст і проростання популярної модельної рослини Arabidopsis thaliana.У дослідженні зв’язку структура-активність ми виявили, що сполука з C9, модифікованою до урсонової кислоти, яка називається нонілоксипохідним урсонової кислоти (KAND), значно посилює інгібуючу дію на ріст і проростання.Примітно, що нещодавно відкритий інгібітор росту рослин також впливав на ріст тютюну та печеночника і не був цитотоксичним для бактерій або клітин HeLa.Крім того, деякі похідні урмотонової кислоти індукують спотворений кореневий фенотип, маючи на увазі, що ці похідні прямо чи опосередковано впливають на мікротрубочки.Згідно з цією ідеєю, наші спостереження за мікротрубочками, міченими імуногістохімічно або флуоресцентними білками, вказують на те, що лікування KAND деполімеризує мікротрубочки.Крім того, лікування похідними кумамотонової кислоти порушувало мікрофіламенти актину.Таким чином, ми виявили новий інгібітор росту рослин, унікальний механізм дії якого полягає в руйнуванні цитоскелета.
Штам MK493-CF1 був виділений із ґрунту в Сінагава-ку, Токіо.Штам MK493-CF1 утворював добре розгалужений стромальний міцелій.Визначено часткову послідовність гена 16S рибосомальної РНК (1422 п.н.).Цей штам дуже схожий на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типовий штам, 99,93%).На основі цього результату було встановлено, що цей штам був тісно пов’язаний із типовим штамом S. werraensis.Тому ми тимчасово назвали цей штам S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T також виробляє ті самі біоактивні сполуки.Оскільки ранніх досліджень щодо отримання натуральних продуктів із цього мікроорганізму мало, проводились подальші хімічні дослідження.Після культивування S. werraensis MK493-CF1 на середовищі ячменю шляхом твердофазної ферментації при 30°C протягом 14 днів середовище екстрагували 50% EtOH.60 мл зразка сушили з отриманням 59,5 мг неочищеного екстракту.Неочищений екстракт піддавали ВЕРХ з оберненою фазою, щоб отримати N-метокси-1Н-пірол-2-карбоксамід (1, названий кумамонамідом, 36,0 мг).Загальна кількість 1 становить приблизно 60% сирого екстракту.Тому ми вирішили детально вивчити властивості кумамотоаміду 1.
Кумамонамід 1 є білим аморфним порошком, і мас-спектрометрія високої роздільної здатності (HRESIMS) підтверджує C6H8N2O2 (рис. 1).С2-заміщений пірольний фрагмент цієї сполуки характеризується δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH в спектрі ЯМР 1H: 4,5 Гц , H-5) і δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр ЯМР 13C показує присутність чотирьох sp2 атомів вуглецю.Присутність амідної групи в положенні С2 оцінювали кореляцією HMBC від протона С-3 до амідного карбонілового вуглецю при δC 161,1.Крім того, піки ЯМР 1 H і 13 C при δH 4,10 (3H, S) і δC 68,3 вказують на присутність N-метоксигруп у молекулі.Хоча правильне положення метоксигрупи ще не було визначено за допомогою спектроскопічного аналізу, такого як розширена різницева спектроскопія та ядерна абревіатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пірол-2-карбоксамід став першою сполукою-кандидатом.
Щоб визначити правильну структуру 1, було виконано повний синтез (рис. 2а).Обробка комерційно доступного 2-амінопіридину 2 m-CPBA призвела до отримання відповідного N-оксиду 3 з кількісним виходом.Після 2-аміноазидування 2 реакцію циклоконденсації, описану Абрамовичем, проводили в бензолі при 90°C, щоб отримати бажаний 1-гідрокси-1Н-пірол-2-карбонітрил 5 у грамах.Швидкість 60% (два етапи).15,16.Потім метилювання та гідроліз 4 дали 1-метокси-1Н-пірол-2-карбонову кислоту (названу «кумотоновою кислотою», 6) з хорошим виходом (70%, дві стадії).Нарешті, амідування за допомогою проміжного продукту 6 хлорангидриду з використанням водного аміаку дало амід Кумамото 1 з виходом 98%.Усі спектральні дані синтезованого 1 були подібні до ізольованого 1, тому була визначена структура 1;
Загальний синтез та аналіз біологічної активності урбенаміду та урбенової кислоти.(a) Загальний синтез аміду Кумамото.(b) Семиденні саджанці дикого типу Arabidopsis Columbia (Col) вирощували на чашках Murashige і Skoog (MS), що містили кумамонамід 6 або кумамонамід 1 у зазначених концентраціях.Масштаб = 1 см.
По-перше, ми оцінили біологічну активність урбенаміду та його проміжних сполук щодо їх здатності модулювати ріст рослин.Ми додавали різні концентрації урмонаміду 1 або урсмонової кислоти 6 до агаризованого середовища MS і культивували на цьому середовищі проростки Arabidopsis thaliana.Ці аналізи показали, що високі концентрації (500 мкМ) 6 пригнічують ріст кореня (рис. 2b).Далі ми створили різні похідні, замінивши позицію N1 на 6, і виконали на них дослідження зв’язків структура-активність (процес аналогового синтезу описаний у допоміжній інформації (SI)).Проростки арабідопсису вирощували на середовищі, що містить 50 мкМ похідних урсонової кислоти, і вимірювали довжину кореня.як показано на малюнку.Як показано на малюнках 3a, b і S1, кумамо кислоти мають різну довжину лінійних алкоксильних ланцюгів (9, 10, 11, 12 і 13) або великих алкоксильних ланцюгів (15, 16 і 17) у положенні N1.Похідні продемонстрували значне пригнічення росту коренів.Крім того, ми виявили, що застосування 200 мкМ 10, 11 або 17 інгібує проростання (рис. 3c і S2).
Вивчення взаємозв'язку структура-активність аміду Кумамото та споріднених сполук.(а) Будова та схема синтезу аналогів.(b) Кількісне визначення довжини кореня 7-денних сіянців, вирощених на середовищі MS з або без 50 мкМ похідних кумамонаміду.Зірочки вказують на значні відмінності від фіктивного лікування (критерій t, стор< 0,05).n>18. Дані показані як середнє ± стандартне відхилення.nt означає «не перевірено», оскільки більше 50% насіння не проросло.(c) Кількісна оцінка швидкості проростання обробленого насіння, інкубованого протягом 7 днів у середовищі MS з або без 200 мкМ кумамонаміду та споріднених сполук.Зірочки вказують на значні відмінності від фіктивного лікування (тест хі-квадрат).n=96.
Цікаво, що додавання алкільних бічних ланцюгів, довших за С9, знижувало інгібіторну активність, що свідчить про те, що сполуки, пов’язані з кумамотоєвою кислотою, потребують бічних ланцюгів певного розміру, щоб проявляти свою біологічну активність.
Оскільки аналіз зв’язку структура-активність показав, що C9 був модифікований до урсонової кислоти, а нонілоксипохідне урсонової кислоти (надалі KAND 11) було найефективнішим інгібітором росту рослин, ми провели більш детальну характеристику KAND 11. Лікування Arabidopsis з 50 мкМ KAND 11 майже повністю запобігав проростанню, тоді як нижчі концентрації (40, 30, 20 або 10 мкМ) KAND 11 пригнічували ріст кореня залежно від дози (рис. 4a, b).Щоб перевірити, чи KAND 11 впливає на життєздатність кореневої меристеми, ми дослідили кореневі меристеми, пофарбовані йодидом пропідію (PI), і виміряли розмір площі меристеми.Розмір меристеми проростків, вирощених на середовищі з вмістом 25 мкМ КАНД-11, становив 151,1 ± 32,5 мкм, тоді як розмір меристеми проростків, вирощених на контрольному середовищі з ДМСО, становив 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4в, г). , що свідчить про те, що KAND-11 відновлює клітинну активність.поширення.Коренева меристема.Відповідно до цього лікування KAND 11 зменшило кількість сигналу маркера поділу клітин CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS у кореневій меристемі (рис. 4e) 17 .Ці результати вказують на те, що KAND 11 пригнічує ріст кореня шляхом зниження активності проліферації клітин.
Аналіз інгібуючої дії похідних урбенонової кислоти (урбенілоксипохідних) на ріст.(a) 7-денні проростки дикого типу Col, вирощені на пластинах MS із зазначеними концентраціями KAND 11. Масштабна шкала = 1 см.(b) Кількісна оцінка довжини кореня.Букви вказують на значні відмінності (тест HSD у Туреччині, с< 0,05).n>16. Дані показані як середнє значення ± SD.(c) Конфокальна мікроскопія пофарбованих йодидом пропідію коренів Col дикого типу, вирощених на чашках MS з або без 25 мкМ KAND 11. Білі дужки вказують на кореневу меристему.Масштабна шкала = 100 мкм.(d) Кількісна оцінка розміру кореневої меристеми (n = 10-11).Статистичні відмінності визначали за допомогою t-критерію (стор< 0,05).Смуги представляють середній розмір меристеми.(e) Мікроскопія диференційного інтерференційного контрасту (DIC) кореневої меристеми, що містить конструкцію CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS пофарбований і пофарбований на 5-денних сіянцях, вирощених на чашках MS з або без аналізу 25 мкМ KAND.
Фітотоксичність KAND 11 була додатково перевірена з використанням іншої дводольної рослини, тютюну (Nicotiana tabacum), і основного модельного організму наземної рослини, печеночника (Marchantia polymorpha).Як і у випадку з Arabidopsis, проростки тютюну SR-1, вирощені на середовищі, що містить 25 мкМ KAND 11, дали коротші корені (рис. 5а).Крім того, 40 із 48 насінин проросли на чашках, що містять 200 мкМ KAND 11, тоді як усі 48 насінин проросли на імітаційно оброблених середовищах, що вказує на те, що більш високі концентрації KAND були значними (p< 0,05;тест хі -квадрат) пригнічує проростання тютюну.(Рис. 5б).Крім того, концентрація KAND 11, яка пригнічувала ріст бактерій у печіночниці, була подібною до ефективної концентрації в Arabidopsis (рис. 5c).Ці результати показують, що KAND 11 може пригнічувати ріст різноманітних рослин.Потім ми досліджували можливу цитотоксичність сполук, пов’язаних із моноамідом ведмедя, в інших організмах, а саме клітинах HeLa людини та штамі Escherichia coli DH5α, як представниках клітин вищих тварин і бактерій відповідно.У серії аналізів клітинної проліферації ми спостерігали, що кумамонамід 1, кумамонамідна кислота 6 і KAND 11 не впливали на ріст клітин HeLa або E. coli при концентраціях 100 мкМ (рис. 5d,e).
Інгібування росту KAND 11 в організмах, що не є арабідопсисом.(a) Двотижневі проростки тютюну дикого типу SR-1 вирощували на вертикально розташованих чашках MS, що містили 25 мкМ KAND 11. (b) Двотижневі проростки тютюну SR-1 дикого типу вирощували на горизонтально розташованих Планшети MS, що містять 200 мкМ KAND 11. (c) Двотижневі бруньки дикого типу Tak-1, вирощені на чашках Gamborg B5 із зазначеними концентраціями KAND 11. Червоні стрілки вказують на спори, які припинили рости протягом двотижневої інкубації. період.(d) Аналіз клітинної проліферації клітин HeLa.Кількість життєздатних клітин вимірювали через фіксовані інтервали часу за допомогою набору для підрахунку клітин 8 (Dojindo).В якості контролю клітини HeLa обробляли 5 мкг/мл актиноміцину D (Act D), який інгібує транскрипцію РНК-полімерази та викликає загибель клітин.Аналізи проводили в трьох повторах.(e) Аналіз проліферації клітин E. coli.Ріст E. coli аналізували шляхом вимірювання OD600.В якості контролю клітини обробляли 50 мкг/мл ампіциліну (Amp), який пригнічує синтез бактеріальної клітинної стінки.Аналізи проводили в трьох повторах.
Щоб розшифрувати механізм дії цитотоксичності, спричиненої урамід-спорідненими сполуками, ми повторно проаналізували похідні урбенової кислоти з помірним інгібуючим ефектом.як показано на малюнку.Як показано на малюнках 2b, 6a, проростки, вирощені на чашках з агаром, що містять високі концентрації (200 мкМ) урмотонової кислоти 6, дали коротші та загнуті вліво коріння (θ = – 23,7 ± 6,1), тоді як проростки, вирощені на контрольному середовищі, сіянці дали майже пряме коріння (θ = – 3,8 ± 7,1).Відомо, що цей характерний косий ріст є результатом дисфункції кортикальних мікротрубочок14,18.Згідно з цим висновком, препарати, що дестабілізують мікротрубочки дизопірамід і оризалін, викликали подібний нахил кореня в наших умовах росту (рис. 2b, 6a).Водночас ми перевірили похідні урмотонової кислоти та відібрали кілька з них, які в певних концентраціях викликали косий ріст кореня.Сполуки 8, 9 і 15 змінили напрямок росту коренів при 75 мкМ, 50 мкМ і 40 мкМ відповідно, вказуючи на те, що ці сполуки можуть ефективно дестабілізувати мікротрубочки (рис. 2b, 6a).Ми також протестували найпотужнішу похідну урсолової кислоти, KAND 11, у нижчій концентрації (15 мкМ) і виявили, що застосування KAND 11 пригнічує ріст коренів і що напрямок росту коренів був нерівномірним, хоча вони мали тенденцію до нахилу вліво ( Малюнок C3)..Оскільки більш високі концентрації препаратів, що дестабілізують мікротрубочки, іноді пригнічують ріст рослин, а не викликають нахил коренів, ми згодом оцінили можливість того, що KAND 11 впливає на мікротрубочки, спостерігаючи за кортикальними мікротрубочками в клітинах кореневого епідермісу.Імуногістохімія з використанням анти-β-тубулінових антитіл у епідермальних клітинах коренів розсади, оброблених 25 мкМ KAND 11, показала зникнення майже всіх кортикальних мікротрубочок у епідермальних клітинах у зоні подовження (рис. 6b).Ці результати вказують на те, що кумамотонова кислота та її похідні діють прямо чи опосередковано на мікротрубочки, руйнуючи їх, і що ці сполуки є новими інгібіторами мікротрубочок.
Урсонова кислота та її похідні змінюють кортикальні мікротрубочки в Arabidopsis thaliana.(a) Кут нахилу кореня, виміряний у присутності різних похідних урмотонової кислоти у зазначених концентраціях.Також були проаналізовані ефекти двох сполук, які, як відомо, пригнічують мікротрубочки: дизопіраміду та оризаліну.На вставці показано стандарт, який використовується для вимірювання кута росту кореня.Зірочки вказують на значні відмінності від фіктивного лікування (критерій t, стор< 0,05).n>19. Масштаб = 1 см.(b) Кортикальні мікротрубочки в клітинах епідермісу в зоні елонгації.Мікротрубочки в коренях Arabidopsis Col дикого типу, вирощених на планшетах MS з 25 мкМ KAND 11 або без нього, візуалізували за допомогою імуногістохімічного фарбування з використанням первинних антитіл до β-тубуліну та кон’югованих з Alexa Fluor вторинних антитіл.Масштабна шкала = 10 мкм.(c) Мітотична структура мікротрубочок у кореневій меристемі.Мікротрубочки візуалізували за допомогою імуногістохімічного фарбування.Мітотичні структури, включаючи профазні зони, веретена і фрагмопласти, підраховували з конфокальних зображень.Стрілки вказують на мітотичні структури мікротрубочок.Зірочки вказують на значні відмінності від фіктивного лікування (критерій t, стор< 0,05).n>9. Масштабна шкала = 50 мкм.
Хоча Ursa має здатність порушувати функцію мікротрубочок, очікується, що механізм його дії буде відрізнятися від типових агентів для деполімеризації мікротрубочок.Наприклад, більш високі концентрації деполімеризаторів мікротрубочок, таких як дизопірамід і оризалін, викликають анізотропне розширення епідермальних клітин, тоді як KAND 11 цього не робить.Крім того, спільне застосування KAND 11 і дизопіраміду призвело до комбінованої відповіді на ріст кореня, викликаної дизопірамідом, і спостерігалося індуковане KAND 11 інгібування росту (рис. S4).Ми також проаналізували реакцію гіперчутливого мутанта дизопіраміду 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 має неканонічну точкову мутацію тубулінкінази та створює коротші корені при лікуванні дизопірамідом9,20.Сіянці мутантів phs1-1, вирощені на агаризованому середовищі, що містить KAND 11, мали коротші корені, подібні до тих, що вирощувалися на дизопіраміді (рис. S5).
Крім того, ми спостерігали мітотичні структури мікротрубочок, такі як зони профази, веретена і фрагмопласти, в кореневій меристемі саджанців, оброблених KAND 11. Відповідно до спостережень для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, значне зниження спостерігали кількість мітотичних мікротрубочок (рис. 6в).
Щоб охарактеризувати цитотоксичність KAND 11 при субклітинному розділенні, ми обробили суспензійні клітини тютюну BY-2 KAND 11 і спостерігали за їх реакцією.Спочатку ми додали KAND 11 до клітин BY-2, що експресують TagRFP-TUA6, який флуоресцентно позначає мікротрубочки, щоб оцінити вплив KAND 11 на кортикальні мікротрубочки.Щільність кортикальних мікротрубочок оцінювали за допомогою аналізу зображень, який кількісно визначав відсоток цитоскелетних пікселів серед цитоплазматичних пікселів.Результати аналізу показали, що після обробки 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 протягом 1 години щільність значно знизилася до 0,94 ± 0,74% або 0,23 ± 0,28% відповідно, тоді як щільність клітин, оброблених ДМСО, становила 1,61 ± 0,34. % (рис. 7а).Ці результати узгоджуються зі спостереженням у Arabidopsis, що лікування KAND 11 індукує деполімеризацію кортикальних мікротрубочок (рис. 6b).Ми також перевірили лінію BY-2 з GFP-ABD-міченими нитками актину після обробки такою ж концентрацією KAND 11 і спостерігали, що обробка KAND 11 порушила нитки актину.Обробка 50 мкМ або 100 мкМ KAND 11 протягом 1 години значно знижувала щільність нитки актину до 1,20 ± 0,62% або 0,61 ± 0,26% відповідно, тоді як щільність в оброблених ДМСО клітинах становила 1,69 ± 0,51% (рис. 2).7б).Ці результати контрастують з ефектами пропізаміду, який не впливає на нитки актину, і латрункуліну B, деполімеризатора актину, який не впливає на мікротрубочки (SI, рис. S6).Крім того, лікування кумамонамідом 1, кумамонамідною кислотою 6 або KAND 11 не вплинуло на мікротрубочки в клітинах HeLa (SI Рисунок S7).Таким чином, вважається, що механізм дії KAND 11 відрізняється від механізму дії відомих руйнівників цитоскелету.Крім того, наше мікроскопічне спостереження за клітинами BY-2, обробленими KAND 11, виявило початок загибелі клітин під час лікування KAND 11 і показало, що частка мертвих клітин, пофарбованих у синій колір Еванса, не збільшилася значно після 30 хвилин лікування KAND 11, тоді як після 90 хвилин обробки 50 мкМ або 100 мкМ KAND кількість мертвих клітин збільшилася до 43,7% або 80,1% відповідно (рис. 7c).У сукупності ці дані вказують на те, що нове похідне урсолової кислоти KAND 11 є специфічним для рослин інгібітором цитоскелета з раніше невідомим механізмом дії.
KAND впливає на кортикальні мікротрубочки, нитки актину та життєздатність клітин BY-2 тютюну.(a) Візуалізація кортикальних мікротрубочок у клітинах BY-2 у присутності TagRFP-TUA6.Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії.Щільність кортикальних мікротрубочок розраховували за мікрофотографіями 25 незалежних клітин.Букви вказують на значні відмінності (тест HSD у Туреччині, с< 0,05).Масштабна шкала = 10 мкм.(b) кортикальні нитки актину в клітинах BY-2, візуалізовані в присутності GFP-ABD2.Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії.Щільність кортикальних ниток актину розраховували за мікрофотографіями 25 незалежних клітин.Букви вказують на значні відмінності (тест HSD у Туреччині, с< 0,05).Масштабна шкала = 10 мкм.(c) Спостереження мертвих клітин BY-2 за допомогою фарбування синім Еванса.Клітини BY-2, оброблені KAND 11 (50 мкМ або 100 мкМ) або ДМСО, досліджували за допомогою світлопольної мікроскопії.n=3.Масштабна шкала = 100 мкм.
Відкриття та застосування нових природних продуктів призвело до значного прогресу в різних аспектах людського життя, включаючи медицину та сільське господарство.Для отримання корисних сполук з природних ресурсів були проведені історичні дослідження.Зокрема, відомо, що актиноміцети є корисними як антипаразитарні антибіотики для нематод завдяки їхній здатності виробляти різні вторинні метаболіти, такі як авермектин, головна сполука івермектину та блеоміцину та його похідні, які використовуються в медицині як протипухлинні засоби21,22.Подібним чином, різноманітні гербіцидні сполуки були виявлені з актиноміцетів, деякі з яких уже використовуються в комерційних цілях1,23.Таким чином, аналіз метаболітів актиноміцетів для виділення природних продуктів з бажаною біологічною активністю вважається ефективною стратегією.У цьому дослідженні ми виявили нову сполуку, кумамонамід, з S. werraensis і успішно її синтезували.Урсонова кислота є синтетичним проміжним продуктом урбенаміду та його похідних.Він може спричинити характерне скручування коренів, проявляти помірну або сильну гербіцидну дію та прямо чи опосередковано пошкоджувати мікротрубочки рослин.Однак механізм дії урмотонової кислоти може відрізнятися від механізму дії існуючих інгібіторів мікротрубочок, оскільки KAND 11 також руйнує нитки актину та спричиняє загибель клітин, що свідчить про регуляторний механізм, за допомогою якого урмотонова кислота та її похідні впливають на широкий спектр цитоскелетних структур..
Подальша детальна характеристика урбенонової кислоти допоможе краще зрозуміти механізм дії урбенонової кислоти.Зокрема, наступною метою є оцінка здатності урсонової кислоти зв’язуватися з відновленими мікротрубочками, щоб визначити, чи діє урсонова кислота та її похідні безпосередньо на мікротрубочки та деполімеризує їх, чи їх дія призводить до дестабілізації мікротрубочок.Крім того, у випадку, коли мікротрубочки не є прямою мішенню, визначення місця дії та молекулярних мішеней урсонової кислоти на рослинних клітинах допоможе глибше зрозуміти властивості споріднених сполук і можливі шляхи покращення гербіцидної активності.Наш аналіз біологічної активності виявив унікальну цитотоксичну здатність урсонової кислоти на ріст таких рослин, як Arabidopsis thaliana, тютюн і печеночник, при цьому ні E. coli, ні клітини HeLa не зазнали впливу.Незначна токсичність або відсутність токсичності для клітин тварин є перевагою похідних урсонової кислоти, якщо вони розроблені як гербіциди для використання на відкритих сільськогосподарських полях.Дійсно, оскільки мікротрубочки є звичайними структурами в еукаріотах, їх вибіркове інгібування в рослинах є ключовою вимогою для гербіцидів.Наприклад, пропізамід, деполімеризуючий агент мікротрубочок, який безпосередньо зв’язується з тубуліном і пригнічує полімеризацію, використовується як гербіцид через його низьку токсичність для клітин тварин24.На відміну від дизопіраміду, споріднені бензаміди мають іншу цільову специфічність.Крім мікротрубочок рослин, RH-4032 або бензоксамід також пригнічує мікротрубочки клітин тварин або ооміцетів відповідно, а заліламід використовується як фунгіцид через його низьку фітотоксичність25,26,27.Нещодавно виявлений ведмідь та його похідні виявляють вибіркову цитотоксичність проти рослин, але варто зазначити, що подальші модифікації можуть змінити їх цільову специфічність, потенційно забезпечуючи додаткові похідні для контролю патогенних грибів або ооміцетів.
Унікальні властивості урбенонової кислоти та її похідних є корисними для їх розробки як гербіцидів і використання як інструментів дослідження.Важливість цитоскелета в контролі форми рослинної клітини широко визнана.Більш ранні дослідження показали, що рослини розвинули складні механізми організації кортикальних мікротрубочок шляхом контролю динаміки мікротрубочок для належного контролю морфогенезу.Було ідентифіковано велику кількість молекул, відповідальних за регуляцію активності мікротрубочок, і відповідні дослідження все ще тривають3,4,28.Наше поточне розуміння динаміки мікротрубочок у рослинних клітинах не повністю пояснює механізми організації кортикальних мікротрубочок.Наприклад, хоча як дизопірамід, так і оризалін можуть деполімеризувати мікротрубочки, дизопірамід викликає серйозне викривлення кореня, тоді як оризалін має відносно м’який ефект.Крім того, мутації в тубуліні, який стабілізує мікротрубочки, також спричиняють правообертання коренів, тоді як паклітаксел, який також стабілізує динаміку мікротрубочок, ні.Таким чином, вивчення та ідентифікація молекулярних мішеней урсолової кислоти має дати нове уявлення про регуляцію кортикальних мікротрубочок рослин.Подібним чином майбутні порівняння хімічних речовин, які є ефективними для стимулювання спотвореного росту, таких як дизопірамід, і менш ефективних хімічних речовин, таких як оризалін або кумамоторна кислота, дадуть підказки про те, як відбувається спотворений ріст.
З іншого боку, пов’язані із захистом цитоскелетні перебудови є ще однією можливістю пояснити цитотоксичність урсонової кислоти.Зараження патогеном або впровадження еліситора в рослинні клітини іноді викликає руйнування цитоскелету та подальшу загибель клітини29.Наприклад, повідомлялося, що отриманий з ооміцетів криптоксантин руйнує мікротрубочки та нитки актину до загибелі клітин тютюну, подібно до того, що відбувається при лікуванні KAND30,31.Подібність між захисними реакціями та клітинними реакціями, викликаними урсоновою кислотою, привела нас до гіпотези, що вони запускають загальні клітинні процеси, хоча очевидна швидша та сильніша дія урсонової кислоти, ніж криптоксантин.Проте дослідження показали, що руйнування актинових ниток сприяє спонтанній загибелі клітин, яка не завжди супроводжується руйнуванням мікротрубочок29.Крім того, ще належить з’ясувати, чи збудник або еліситор викликає спотворений ріст коренів, як це роблять похідні урсонової кислоти.Таким чином, молекулярні знання, що пов’язують захисні реакції та цитоскелет, є привабливою проблемою, яку потрібно вирішити.Використовуючи наявність сполук з низькою молекулярною масою, пов’язаних з урсоновою кислотою, а також ряду похідних з різною дією, вони можуть надати можливості для націлювання на невідомі клітинні механізми.
Взяті разом, відкриття та застосування нових сполук, які модулюють динаміку мікротрубочок, забезпечать потужні методи вирішення складних молекулярних механізмів, що лежать в основі визначення форми рослинної клітини.У цьому контексті нещодавно розроблена сполука урмотонової кислоти, яка впливає на мікротрубочки та нитки актину та індукує загибель клітин, може дати можливість розшифрувати зв’язок між контролем мікротрубочок та цими іншими механізмами.Таким чином, хімічний і біологічний аналіз з використанням урбенонової кислоти допоможе нам зрозуміти молекулярні регуляторні механізми, які контролюють цитоскелет рослин.
Інокулюйте S. werraensis MK493-CF1 у 500 мл колбу Ерленмейера з перегородкою, що містить 110 мл посівного середовища, що складається з 2% (маса/об’єм) галактози, 2% (маса/об’єм) пасти Essence, 1% (маса/об’єм) складу Bacto .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (мас./об.) кукурудзяного екстракту (KOGOSTCH Co., Ltd., Японія), 0,2% (мас./об.) (NH4)2SO4 і 0,2% CaCO3 в деіонізованій воді.(рН 7,4 до стерилізації).Посівні культури інкубували на ротаційному шейкері (180 об/хв) при 27°C протягом 2 днів.Культивування продукції методом твердофазної ферментації.Посівну культуру (7 мл) переносили в колбу K-1 об’ємом 500 мл, що містила 40 г виробничого середовища, що складається з 15 г пресованого ячменю (MUSO Co., Ltd., Японія) і 25 г деіонізованої води (рН не відкоригований). перед стерилізацією).).Ферментацію проводили при 30°С у темряві протягом 14 днів.Ферментаційний матеріал екстрагували 40 мл/пляшку EtOH і центрифугували (1500 g, 4°C, 10 хв).Супернатант культури (60 мл) екстрагували сумішшю 10% MeOH/EtOAc.Органічний шар випарювали при зниженому тиску з отриманням залишку (59,5 мг), який піддавали ВЕРХ з градієнтним елююванням (0–10 хвилин: 90%) на колонці з оберненою фазою (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × довжина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 хвилин: від 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градієнт), 35–45 хвилин: 90% H2O/EtOH, 45–155 хвилин: 90% H2O /EtOH до 100% EtOH (градієнт (градієнт), 155–200 хв: 100% EtOH) при швидкості потоку 1,5 мл/хв, виділяли кумамонамід (1, 36,0 мг) у вигляді білого аморфного порошку.
Кумамотоамід (1);1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (т, J = 2,5 Гц, 1Н), 6,76 (дд, J = 4,3, 1,8 Гц 1Н), 6,05 (т, J = 3,8 Гц, 1Н).), 4,08 (с, 3H);13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ розраховане значення: 141,0659, виміряне значення: 141,0663, ІЧ νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Насіння Columbia (Col-0) було отримано від Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) з дозволом на дослідницьке використання.Насіння Col-0 розмножували та підтримували в наших лабораторних умовах і використовували як рослини Arabidopsis дикого типу.Насіння арабідопсису поверхнево стерилізували та культивували в середовищі Мурасіге та Скуга половинної міцності, що містило 2% сахарози (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (мас./об.) 2-(4-морфоліно)етансульфонової кислоти (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) і 1,5% агару (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при 23 °C і постійному освітленні.Насіння мутанта phs1-1 надав Т. Хашимото (Нарський інститут науки і технологій).
Насіння штаму SR-1 було надано T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) і використано як рослини тютюну дикого типу.Насіння тютюну поверхнево стерилізували та замочували у стерильній воді на три ночі для сприяння проростанню, потім поміщали в розчин половинної концентрації, що містить 2% сахарози, 0,05% (мас./об.) MES і 0,8% гелланової камеді (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурасіге.і середовище Скуга) з рН 5,7 та інкубували при 23°C при постійному освітленні.
Штам Tak-1 був наданий T. Kohchi (Університет Кіото) і використовувався як стандартна експериментальна одиниця для дослідження печеночника.Gemma отримували зі стерилізованих культивованих рослин, а потім висівали на середовище Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), що містило 1% сахарози та 0,3% гелланової камеді, та інкубували при 23°C при постійному освітленні.
Клітини тютюну BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) були надані S. Hasezawa (Університет Токіо).Клітини BY-2 розводили в 95 разів у модифікованому середовищі Лінсмайєра та Скуга та щотижня доповнювали 2,4-дихлорфеноксіоцтовою кислотою 32 .Клітинну суспензію змішували на роторному шейкері при 130 об/хв при 27°C у темряві.Промийте клітини 10-кратним об’ємом свіжого середовища та ресуспендуйте в цьому ж середовищі.Трансгенні клітинні лінії BY-2, що стабільно експресують маркер мікротрубочок TagRFP-TUA6 або маркер актинових ниток GFP-ABD2 під промотором 35S вірусу мозаїки цвітної капусти, були створені, як описано 33,34,35.Ці клітинні лінії можна підтримувати та синхронізувати за допомогою процедур, подібних до тих, що використовуються для вихідної клітинної лінії BY-2.
Клітини HeLa культивували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (DMEM) (Life Technologies), доповненому 10% фетальної бичачої сироватки, 1,2 ОД/мл пеніциліну та 1,2 мкг/мл стрептоміцину в інкубаторі при 37°C з 5% CO2.
Усі експерименти, описані в цьому рукописі, проводилися відповідно до японських правил біобезпеки та вказівок.
Сполуки розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) у вигляді вихідних розчинів і розводили в середовищі MS для Arabidopsis і тютюну або середовищі Gamborg B5 для печеночника.Для аналізу пригнічення росту коренів більше 10 насінин на чашку висівали на агаризоване середовище, що містить зазначені сполуки або ДМСО.Насіння інкубували в ростовій камері протягом 7 днів.Саджанці сфотографували та виміряли довжину коренів.Для аналізу проростання арабідопсису 48 насінин на чашку висівали на агаризоване середовище, що містить 200 мкМ сполуки або ДМСО.Насіння арабідопсису вирощували в ростовій камері та підраховували кількість пророслих сходів через 7 днів після проростання (даг).Для аналізу проростання тютюну 24 насінини на чашку висівали на агаризоване середовище, що містить 200 мкМ KAND або DMSO.Насіння тютюну вирощували в ростовій камері і через 14 днів підраховували кількість пророслих сходів.Для аналізу інгібування росту печеночника 9 ембріонів з кожної чашки поміщали на агаризоване середовище, що містить зазначені концентрації KAND або DMSO, та інкубували в камері для росту протягом 14 днів.
Використовуйте саджанці, пофарбовані 5 мг/мл йодиду пропідію (PI), щоб візуалізувати організацію кореневої меристеми.Сигнали PI спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням конфокального лазерного скануючого мікроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гістохімічне фарбування коренів β-глюкуронідазою (GUS) проводили згідно з протоколом, описаним Malami і Benfey36.Проростки фіксували в 90% ацетоні протягом ночі, фарбували 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-d-глюкуронової кислоти в буфері GUS протягом 1 години і поміщали в гідратований розчин хлоральдегіду.(8 г хлоралгідрату, 2 мл води та 1 мл гліцерину) і спостерігали за допомогою диференціальної інтерференційної контрастної мікроскопії з використанням мікроскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Кути коренів вимірювали на 7-денних проростках, вирощених на вертикально розміщених пластинах.Виміряйте кут кореня від напрямку вектора сили тяжіння, як описано в кроці 6.
Розташування кортикальних мікротрубочок спостерігали, як описано, з незначними змінами в протоколі 37 .Анти-β-тубулінове антитіло (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) і Alexa Fluor 488-кон’югований антимишачий IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) використовували як первинні та вторинні антитіла в розведеннях 1:1000 і 1:100, відповідно.Флуоресцентні зображення були отримані за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).Отримайте зображення Z-stack і створіть проекції максимальної інтенсивності відповідно до інструкцій виробника.
Аналіз проліферації клітин HeLa проводили з використанням набору для підрахунку клітин 8 (Dojindo) відповідно до інструкцій виробника.
Ріст E. coli DH5α аналізували шляхом вимірювання щільності клітин у культурі за допомогою спектрофотометра при 600 нм (OD600).
Організацію цитоскелета в трансгенних клітинах BY-2 спостерігали за допомогою флуоресцентного мікроскопа, оснащеного конфокальним скануючим пристроєм CSU-X1 (Yokogawa) і камерою sCMOS (Zyla, Andor Technology).Щільність цитоскелета оцінювали за допомогою аналізу зображень, який кількісно визначав відсоток цитоскелетних пікселів серед цитоплазматичних пікселів у конфокальних зображеннях за допомогою програмного забезпечення ImageJ, як описано38,39.
Щоб виявити загибель клітин у клітинах BY-2, аліквоту клітинної суспензії інкубували з 0,05% синім Еванса протягом 10 хвилин при кімнатній температурі.Селективне фарбування мертвих клітин синім за Евансом залежить від екструзії барвника з життєздатних клітин інтактною плазматичною мембраною40.Пофарбовані клітини спостерігали за допомогою світлопольного мікроскопа (BX53, Olympus).
Клітини HeLa вирощували в DMEM з додаванням 10% FBS у зволоженому інкубаторі при 37°C і 5% CO2.Клітини обробляли 100 мкМ KAND 11, кумамонамідовою кислотою 6, кумамонамідом 1, 100 нг/мл колцеміду (Gibco) або 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) протягом 6 годин при 37°C.Клітини фіксували MetOH протягом 10 хв, а потім ацетатом протягом 5 хв при кімнатній температурі.Фіксовані клітини інкубували з первинним антитілом до β-тубуліну (1D4A4, Proteintech: 66240-1), розведеним у 0,5% BSA/PBS, протягом 2 годин, промивали 3 рази TBST, а потім інкубували з козячим антитілом Alexa Fluor.488 1 година.– IgG миші (Thermo Fisher Scientific: A11001) і 15 нг/мл 4′,6-діамідіно-2-феніліндолу (DAPI), розведеного в 0,5% BSA/PBS.Після тричі промивання TBST пофарбовані клітини спостерігали на інвертованому мікроскопі Nikon Eclipse Ti-E.Зображення були зроблені за допомогою охолоджуваної камери Hamamatsu ORCA-R2 CCD з використанням програмного забезпечення MetaMorph (Molecular Devices).
Час публікації: 17 червня 2024 р