Щоб ефективноборотьба з комарамита зменшення захворюваності на хвороби, які вони переносять, необхідні стратегічні, стійкі та екологічно чисті альтернативи хімічним пестицидам. Ми оцінили насіннєвий шрот з деяких видів Brassicaceae (родина Brassica) як джерело рослинних ізотіоціанатів, отриманих шляхом ферментативного гідролізу біологічно неактивних глюкозинолатів, для використання в боротьбі з єгипетським Aedes (L., 1762). П'ятиразове знежирення насіннєвого шроту (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 та Thlaspi arvense – три основні типи термічної інактивації та ферментативного розкладу. Хімічні продукти. Визначити токсичність (LC50) алілізотіоціанату, бензилізотіоціанату та 4-гідроксибензилізотіоціанату для личинок Aedes aegypti при 24-годинній експозиції = 0,04 г/120 мл dH2O). Значення LC50 для гірчиці, білої гірчиці та хвоща польового. Насіннєвий шрот становив 0,05, 0,08 та 0,05 відповідно порівняно з алілізотіоціанатом (LC50 = 19,35 ppm) та 4.2-гідроксибензилізотіоціанат (LC50 = 55,41 ppm) був більш токсичним для личинок через 24 години після обробки, ніж 0,1 г/120 мл dH2O відповідно. Ці результати узгоджуються з виробництвом насіннєвого шроту люцерни. Вища ефективність бензилових ефірів відповідає розрахованим значенням LC50. Використання насіннєвого шроту може забезпечити ефективний метод боротьби з комарами. Дослідження ефективності порошку насіння хрестоцвітих та його основних хімічних компонентів проти личинок комарів показує, як природні сполуки в порошку насіння хрестоцвітих можуть служити перспективним екологічно чистим ларвіцидом для боротьби з комарами.
Трансмисивні захворювання, спричинені комарами Aedes, залишаються серйозною глобальною проблемою громадського здоров'я. Захворюваність на захворювання, що передаються комарами, поширюється географічно1,2,3 та повторно виникає, що призводить до спалахів важких захворювань4,5,6,7. Поширення захворювань серед людей і тварин (наприклад, чикунгунья, денге, лихоманки долини Рифт, жовтої лихоманки та вірусу Зіка) є безпрецедентним. Тільки лихоманка денге наражає на ризик зараження приблизно 3,6 мільярда людей у тропіках, при цьому щорічно відбувається приблизно 390 мільйонів інфекцій, що призводить до 6 100–24 300 смертей на рік8. Повторна поява та спалах вірусу Зіка в Південній Америці привернули увагу всього світу через пошкодження мозку, яке він спричиняє у дітей, народжених інфікованими жінками2. Кремер та ін.3 прогнозують, що географічний ареал комарів Aedes продовжуватиме розширюватися, і що до 2050 року половина населення світу буде під загрозою зараження арбовірусами, що передаються комарами.
За винятком нещодавно розроблених вакцин проти денге та жовтої лихоманки, вакцини проти більшості хвороб, що передаються комарами, ще не розроблені9,10,11. Вакцини все ще доступні в обмежених кількостях і використовуються лише в клінічних випробуваннях. Контроль над комарами-переносниками за допомогою синтетичних інсектицидів був ключовою стратегією контролю поширення хвороб, що передаються комарами12,13. Хоча синтетичні пестициди ефективні у знищенні комарів, їхнє подальше використання негативно впливає на нецільові організми та забруднює навколишнє середовище14,15,16. Ще більш тривожною є тенденція до зростання стійкості комарів до хімічних інсектицидів17,18,19. Ці проблеми, пов'язані з пестицидами, прискорили пошук ефективних та екологічно чистих альтернатив для боротьби з переносниками хвороб.
Різні рослини були розроблені як джерела фітопестицидів для боротьби зі шкідниками20,21. Рослинні речовини, як правило, є екологічно чистими, оскільки вони біорозкладні та мають низьку або незначну токсичність для нецільових організмів, таких як ссавці, риби та земноводні20,22. Відомо, що рослинні препарати виробляють різноманітні біоактивні сполуки з різними механізмами дії для ефективного контролю різних стадій життєвого циклу комарів23,24,25,26. Сполуки рослинного походження, такі як ефірні олії та інші активні рослинні інгредієнти, привернули увагу та проклали шлях для інноваційних інструментів для боротьби з комарами-переносниками. Ефірні олії, монотерпени та сесквітерпени діють як репеленти, засоби, що відлякують годування, та овициди27,28,29,30,31,32,33. Багато рослинних олій викликають загибель личинок, лялечок та дорослих комарів34,35,36, впливаючи на нервову, дихальну, ендокринну та інші важливі системи комах37.
Нещодавні дослідження дали уявлення про потенційне використання рослин гірчиці та їхнього насіння як джерела біологічно активних сполук. Шрот з гірчичного насіння був випробуваний як біофумігант38,39,40,41 та використаний як ґрунтовий додатковий засіб для придушення бур'янів42,43,44 та контролю ґрунтових фітопатогенів45,46,47,48,49,50, нематод 41,51, 52, 53, 54 та шкідників 55, 56, 57, 58, 59, 60. Фунгіцидна активність цих порошків насіння пояснюється захисними сполуками для рослин, які називаються ізотіоціанати38,42,60. У рослинах ці захисні сполуки зберігаються в клітинах рослин у формі небіоактивних глюкозинолатів. Однак, коли рослини пошкоджуються внаслідок живлення комахами або зараження патогенами, глюкозинолати гідролізуються мірозиназою на біоактивні ізотіоціанати55,61. Ізотіоціанати – це леткі сполуки, які, як відомо, мають широкий спектр антимікробної та інсектицидної активності, а їхня структура, біологічна активність та вміст значно варіюються серед видів Brassicaceae42,59,62,63.
Хоча відомо, що ізотіоціанати, отримані з шроту з насіння гірчиці, мають інсектицидну активність, даних про біологічну активність проти медично важливих членистоногих переносників бракує. У нашому дослідженні вивчали ларвіцидну активність чотирьох знежирених порошків насіння проти комарів Aedes. Личинки Aedes aegypti. Метою дослідження було оцінити їх потенційне використання як екологічно чистих біопестицидів для боротьби з комарами. Три основні хімічні компоненти насіннєвого борошна, алілізотіоціанат (AITC), бензилізотіоціанат (BITC) та 4-гідроксибензилізотіоціанат (4-HBITC), також були протестовані для перевірки біологічної активності цих хімічних компонентів на личинках комарів. Це перший звіт, в якому оцінюється ефективність чотирьох порошків з насіння капусти та їх основних хімічних компонентів проти личинок комарів.
Лабораторні колонії Aedes aegypti (штам Рокфеллера) утримувалися при температурі 26°C, відносній вологості (RH) 70% та фотоперіоді 10:14 (фотоперіод L:D). Парованих самок розміщували в пластикових клітках (висота 11 см та діаметр 9,5 см) та годували через систему пляшечкового годування цитратованою бичачою кров’ю (HemoStat Laboratories Inc., Діксон, Каліфорнія, США). Годування кров’ю здійснювалося як завжди за допомогою мембранної багатоскляної годівниці (Chemglass, Life Sciences LLC, Вайнленд, Нью-Джерсі, США), підключеної до трубки з циркулюючою водяною банею (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) з контролем температури 37°C. На дно кожної скляної камери годівниці (площа 154 мм2) натягували плівку Parafilm M. Потім кожну годівницю розміщували на верхній сітці, що покриває клітку, що містила парувальну самку. Приблизно 350–400 мкл бичачої крові додавали до скляної лійки-годівниці за допомогою піпетки Пастера (Fisherbrand, Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), і дорослим черв'якам давали стікати протягом щонайменше однієї години. Потім вагітним самкам давали 10% розчин сахарози та дозволяли відкладати яйця на вологий фільтрувальний папір, викладений в окремі надпрозорі стаканчики для суфле (розміром 1,25 рідких унцій, Dart Container Corp., Мейсон, Мічиган, США). Потім наповнювали клітку водою. Помістіть фільтрувальний папір з яйцями в герметичний пакет (SC Johnsons, Расін, Вісконсин) і зберігайте при температурі 26°C. Яйця вилуплювали, і приблизно 200–250 личинок вирощували в пластикових лотках, що містили суміш корму для кроликів (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Мішн, Канзас, США) та порошку з печінки (MP Biomedicals, LLC, Солон, Огайо, США) та рибного філе (TetraMin, Tetra GMPH, Меер, Німеччина) у співвідношенні 2:1:1. У наших біологічних аналізах використовували личинок пізньої третьої стадії.
Насіннєвий матеріал рослин, використаний у цьому дослідженні, був отриманий з таких комерційних та державних джерел: Brassica juncea (гірчиця коричнева - Pacific Gold) та Brassica juncea (гірчиця біла - Ida Gold) від Тихоокеанського північно-західного фермерського кооперативу, штат Вашингтон, США; (крес-салат садовий) від Kelly Seed and Hardware Co., Піорія, Іллінойс, США та Thlaspi arvense (крес-салат польовий - Elisabeth) від USDA-ARS, Піорія, Іллінойс, США; Жодне з насіння, використаного в дослідженні, не було оброблено пестицидами. Весь насіннєвий матеріал був оброблений та використаний у цьому дослідженні відповідно до місцевих та національних норм, а також з дотриманням усіх відповідних місцевих, державних та національних норм. У цьому дослідженні не вивчалися трансгенні сорти рослин.
Насіння Brassica juncea (PG), люцерни (Ls), гірчиці білої (IG) та Thlaspi arvense (DFP) подрібнювали до дрібного порошку за допомогою ультрацентробіжного млина Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Німеччина), оснащеного сіткою 0,75 мм та ротором з нержавіючої сталі, 12 зубцями, 10 000 об/хв (Таблиця 1). Порошок подрібненого насіння переносили в паперовий барабан та знежирювали гексаном в апараті Сокслета протягом 24 годин. Підзразок знежиреної польової гірчиці обробляли термообробкою при 100 °C протягом 1 години для денатурації мірозинази та запобігання гідролізу глюкозинолатів з утворенням біологічно активних ізотіоціанатів. Термічно оброблений порошок насіння хвоща польового (DFP-HT) використовували як негативний контроль шляхом денатурації мірозинази.
Вміст глюкозинолатів у знежиреному насіннєвому шроті визначали у трьох повторностях за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) згідно з раніше опублікованим протоколом 64. Коротко кажучи, до 250 мг зразка знежиреного порошку насіння додали 3 мл метанолу. Кожен зразок обробляли ультразвуком на водяній бані протягом 30 хвилин і залишали в темряві при температурі 23°C на 16 годин. Потім 1 мл аліквоти органічного шару фільтрували через фільтр 0,45 мкм в автосамплер. Працюючи на системі ВЕРХ Shimadzu (два насоси LC 20AD; автосамплер SIL 20A; дегазатор DGU 20A; УФ-ВІС детектор SPD-20A для моніторингу при 237 нм; та модуль комунікаційної шини CBM-20A), вміст глюкозинолатів у насіннєвому шроті визначали у трьох повторностях за допомогою програмного забезпечення Shimadzu LC Solution версії 1.25 (Shimadzu Corporation, Колумбія, Меріленд, США). Колонка була колонкою з оберненою фазою C18 Inertsil (250 мм × 4,6 мм; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Торранс, Каліфорнія, США). Початкові умови рухомої фази були встановлені на рівні 12% метанолу/88% 0,01 М гідроксиду тетрабутиламонію у воді (TBAH; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Після введення 15 мкл зразка початкові умови підтримували протягом 20 хвилин, а потім співвідношення розчинників доводили до 100% метанолу, із загальним часом аналізу зразка 65 хвилин. Стандартну криву (на основі нМ/мАт) побудували шляхом серійних розведень свіжоприготованих стандартів синапіну, глюкозинолату та мірозину (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) для оцінки вмісту сірки в знежиреному насіннєвому шроті глюкозинолатів. Концентрації глюкозинолатів у зразках були перевірені на ВЕРХ-системі Agilent 1100 (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США) з використанням OpenLAB CDS ChemStation версії (C.01.07 SR2 [255]), оснащеної тією ж колонкою, та за допомогою раніше описаного методу. Концентрації глюкозинолатів були визначені таким чином, щоб вони були порівнянними між системами ВЕРХ.
Алілізотіоціанат (94%, стабільний) та бензилізотіоціанат (98%) були придбані у Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Волтем, Массачусетс, США). 4-Гідроксибензилізотіоціанат був придбаний у ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, Каліфорнія, США). При ферментативному гідролізі мірозиназою глюкозинолати, глюкозинолати та глюкозинолати утворюють алілізотіоціанат, бензилізотіоціанат та 4-гідроксибензилізотіоціанат відповідно.
Лабораторні біологічні аналізи проводили за методом Мутурі та ін.32 з модифікаціями. У дослідженні використовували п'ять знежирених насіннєвих кормів: DFP, DFP-HT, IG, PG та Ls. Двадцять личинок помістили в одноразовий триходовий стакан об'ємом 400 мл (VWR International, LLC, Раднор, Пенсільванія, США), що містив 120 мл деіонізованої води (dH2O). Сім концентрацій насіннєвого борошна було протестовано на токсичність личинок комарів: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 та 0,12 г насіннєвого борошна/120 мл dH2O для насіннєвого борошна DFP, DFP-HT, IG та PG. Попередні біологічні аналізи показують, що знежирене насіннєве борошно Ls є більш токсичним, ніж чотири інші протестовані насіннєві борошна. Таким чином, ми скоригували сім концентрацій обробки насіннєвого шроту Ls до таких концентрацій: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 та 0,075 г/120 мл dH2O.
Для оцінки нормальної смертності комах в умовах дослідження було включено необроблену контрольну групу (dH20, без добавки насіннєвого борошна). Токсикологічні біологічні аналізи для кожного насіннєвого борошна включали три повторні трисхилі склянки (20 личинок пізнього третього віку на склянку), загалом 108 флаконів. Оброблені контейнери зберігали при кімнатній температурі (20-21°C), а смертність личинок реєстрували протягом 24 та 72 годин безперервного впливу оброблюваних концентрацій. Якщо тіло та придатки комара не рухаються при проколюванні або дотику тонким шпателем з нержавіючої сталі, личинки комарів вважаються мертвими. Мертві личинки зазвичай залишаються нерухомими в дорсальному або вентральному положенні на дні контейнера або на поверхні води. Експеримент повторювали тричі в різні дні з використанням різних груп личинок, загалом 180 личинок, які зазнали впливу кожної оброблюваної концентрації.
Токсичність AITC, BITC та 4-HBITC для личинок комарів оцінювали за допомогою тієї ж процедури біоаналізу, але з різними обробками. Приготували розчини з концентрацією 100 000 ppm для кожної хімічної речовини, додавши 100 мкл хімічної речовини до 900 мкл абсолютного етанолу в 2-мл центрифужній пробірці та струшуючи протягом 30 секунд для ретельного перемішування. Концентрації для обробки визначали на основі наших попередніх біоаналізів, які виявили, що BITC набагато токсичніший, ніж AITC та 4-HBITC. Для визначення токсичності використовували 5 концентрацій BITC (1, 3, 6, 9 та 12 ppm), 7 концентрацій AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 та 35 ppm) та 6 концентрацій 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 та 35 ppm (30, 45, 60, 75 та 90 ppm). Контрольну обробку вводили 108 мкл абсолютного етанолу, що еквівалентно максимальному об'єму хімічної обробки. Біологічні аналізи повторювали, як зазначено вище, піддаючи впливу загалом 180 личинок на кожну концентрацію обробки. Смертність личинок реєстрували для кожної концентрації AITC, BITC та 4-HBITC після 24 годин безперервного впливу.
Пробіт-аналіз 65 даних про смертність, пов'язану з дозою, було проведено за допомогою програмного забезпечення Polo (Polo Plus, LeOra Software, версія 1.0) для розрахунку 50% летальної концентрації (LC50), 90% летальної концентрації (LC90), нахилу, коефіцієнта летальної дози та 95% летальної концентрації на основі довірчих інтервалів для співвідношень летальних доз для логарифмічних кривих концентрації та кривих доза-смертність. Дані про смертність базуються на об'єднаних повторних даних 180 личинок, які зазнали впливу кожної концентрації обробки. Ймовірнісні аналізи проводилися окремо для кожного насіннєвого борошна та кожного хімічного компонента. Виходячи з 95% довірчого інтервалу співвідношення летальних доз, токсичність насіннєвого борошна та хімічних складових для личинок комарів вважалася суттєво різною, тому довірчий інтервал, що містить значення 1, не суттєво відрізнявся, P = 0,0566.
Результати ВЕРХ для визначення основних глюкозинолатів у знежиреному борошні з насіння DFP, IG, PG та Ls наведено в таблиці 1. Основні глюкозинолати в протестованому борошні з насіння варіювалися, за винятком DFP та PG, які обидва містили мірозиназні глюкозинолати. Вміст мірозиніну в PG був вищим, ніж у DFP, 33,3 ± 1,5 та 26,5 ± 0,9 мг/г відповідно. Порошок насіння Ls містив 36,6 ± 1,2 мг/г глюкоглікону, тоді як порошок насіння IG містив 38,0 ± 0,5 мг/г синапіну.
Личинки комарів Ae. Aedes aegypti гинули при обробці знежиреним насіннєвим борошном, хоча ефективність обробки варіювалася залежно від виду рослини. Тільки DFP-NT не був токсичним для личинок комарів після 24 та 72 годин впливу (Таблиця 2). Токсичність активного порошку насіння зростала зі збільшенням концентрації (Рис. 1A, B). Токсичність насіннєвого борошна для личинок комарів значно варіювалася на основі 95% ДІ співвідношення летальної дози значень LC50 при 24-годинній та 72-годинній оцінках (Таблиця 3). Через 24 години токсичний ефект насіннєвого борошна Ls був більшим, ніж при інших обробках насіннєвим борошном, з найвищою активністю та максимальною токсичністю для личинок (LC50 = 0,04 г/120 мл dH2O). Личинки були менш чутливими до DFP через 24 години порівняно з обробкою порошком насіння IG, Ls та PG, зі значеннями LC50 0,115, 0,04 та 0,08 г/120 мл dH2O відповідно, що було статистично вищим за значення LC50 0,211 г/120 мл dH2O (Таблиця 3). Значення LC90 DFP, IG, PG та Ls становили 0,376, 0,275, 0,137 та 0,074 г/120 мл dH2O відповідно (Таблиця 2). Найвища концентрація DPP становила 0,12 г/120 мл dH2O. Після 24 годин оцінки середня смертність личинок становила лише 12%, тоді як середня смертність личинок IG та PG досягла 51% та 82% відповідно. Після 24 годин оцінювання середня смертність личинок для обробки насіннєвим шротом Ls найвищою концентрацією (0,075 г/120 мл dH2O) становила 99% (рис. 1A).
Криві смертності були оцінені за дозою-відповіддю (Probit) личинок Ae. Egyptian (личинки 3-го віку) на концентрацію насіннєвого борошна через 24 години (A) та 72 години (B) після обробки. Пунктірна лінія позначає LC50 обробки насіннєвого борошна. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT інактивований нагріванням Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
При 72-годинній оцінці значення LC50 для насіннєвого борошна DFP, IG та PG становили 0,111, 0,085 та 0,051 г/120 мл dH2O відповідно. Майже всі личинки, які зазнали впливу насіннєвого борошна Ls, загинули після 72 годин впливу, тому дані про смертність не відповідали аналізу Probit. Порівняно з іншим насіннєвим борошном, личинки були менш чутливі до обробки насіннєвим борошном DFP та мали статистично вищі значення LC50 (таблиці 2 та 3). Через 72 години значення LC50 для обробки насіннєвим борошном DFP, IG та PG оцінювалися як 0,111, 0,085 та 0,05 г/120 мл dH2O відповідно. Після 72 годин оцінки значення LC90 для порошків насіння DFP, IG та PG становили 0,215, 0,254 та 0,138 г/120 мл dH2O відповідно. Після 72 годин оцінювання середня смертність личинок для обробки насіннєвим шротом DFP, IG та PG при максимальній концентрації 0,12 г/120 мл dH2O становила 58%, 66% та 96% відповідно (рис. 1B). Після 72-годинного оцінювання було виявлено, що насіннєвий шрот PG є більш токсичним, ніж насіннєвий шрот IG та DFP.
Синтетичні ізотіоціанати, алілізотіоціанат (AITC), бензилізотіоціанат (BITC) та 4-гідроксибензилізотіоціанат (4-HBITC) можуть ефективно знищувати личинки комарів. Через 24 години після обробки BITC був більш токсичним для личинок зі значенням LC50 5,29 ppm порівняно з 19,35 ppm для AITC та 55,41 ppm для 4-HBITC (Таблиця 4). Порівняно з AITC та BITC, 4-HBITC має нижчу токсичність та вище значення LC50. Існують значні відмінності в токсичності для личинок комарів двох основних ізотіоціанатів (Ls та PG) у найпотужнішому насіннєвому борошні. Токсичність, заснована на співвідношенні летальних доз значень LC50 між AITC, BITC та 4-HBITC, показала статистичну різницю, таку що 95% ДІ співвідношення летальних доз LC50 не включав значення 1 (P = 0,05, Таблиця 4). За оцінками, найвищі концентрації як BITC, так і AITC знищували 100% протестованих личинок (Рисунок 2).
Криві смертності були розраховані за дозою-відповіддю (Probit) Ae. Через 24 години після обробки єгипетські личинки (личинки 3-го віку) досягли концентрації синтетичного ізотіоціанату. Пунктирна лінія позначає LC50 для обробки ізотіоціанатом. Бензилізотіоціанат BITC, алілізотіоціанат AITC та 4-HBITC.
Використання рослинних біопестицидів як засобів боротьби з комарами-переносниками вивчається вже давно. Багато рослин виробляють природні хімічні речовини, що мають інсектицидну активність37. Їхні біоактивні сполуки є привабливою альтернативою синтетичним інсектицидам з великим потенціалом у боротьбі зі шкідниками, включаючи комарів.
Гірчицю вирощують як культуру заради насіння, використовують як спецію та джерело олії. Коли з насіння екстрагують гірчичну олію або коли гірчицю екстрагують для використання як біопаливо, 69 побічним продуктом є знежирене насіннєве борошно. Це насіннєве борошно зберігає багато своїх природних біохімічних компонентів та гідролітичних ферментів. Токсичність цього насіннєвого борошна пояснюється утворенням ізотіоціанатів 55, 60, 61. Ізотіоціанати утворюються шляхом гідролізу глюкозинолатів ферментом мірозиназою під час гідратації насіннєвого борошна 38, 55, 70 і, як відомо, мають фунгіцидну, бактерицидну, нематоцидну та інсектицидну дію, а також інші властивості, включаючи хімічні сенсорні ефекти та хіміотерапевтичні властивості 61, 62, 70. Кілька досліджень показали, що гірчиця та насіннєве борошно ефективно діють як фуміганти проти ґрунтових та запасених харчових шкідників 57, 59, 71, 72. У цьому дослідженні ми оцінили токсичність чотиринасінного шроту та його трьох біоактивних продуктів: AITC, BITC та 4-HBITC, для личинок комарів Aedes. Aedes aegypti. Очікується, що додавання насіннєвого шроту безпосередньо до води, що містить личинки комарів, активує ферментативні процеси, що утворюють ізотіоціанати, токсичні для личинок комарів. Ця біотрансформація була частково продемонстрована спостережуваною ларвіцидною активністю насіннєвого шроту та втратою інсектицидної активності, коли шрот з насіння карликової гірчиці був термічно оброблений перед використанням. Очікується, що термічна обробка руйнує гідролітичні ферменти, які активують глюкозинолати, тим самим запобігаючи утворенню біоактивних ізотіоціанатів. Це перше дослідження, яке підтверджує інсектицидні властивості порошку насіння капусти проти комарів у водному середовищі.
Серед протестованих порошків насіння, порошок насіння крес-салату (Ls) був найтоксичнішим, спричиняючи високу смертність Aedes albopictus. Личинки Aedes aegypti оброблялися безперервно протягом 24 годин. Решта трьох порошків насіння (PG, IG та DFP) мали повільнішу активність і все ще спричиняли значну смертність після 72 годин безперервної обробки. Тільки насіннєвий шрот Ls містив значну кількість глюкозинолатів, тоді як PG та DFP містили мірозиназу, а IG містив глюкозинолат як основний глюкозинолат (Таблиця 1). Глюкотропаелін гідролізується до BITC, а синальбін гідролізується до 4-HBITC61,62. Результати нашого біологічного аналізу показують, що як насіннєвий шрот Ls, так і синтетичний BITC є високотоксичними для личинок комарів. Основним компонентом насіннєвого шроту PG та DFP є глюкозинолат мірозинази, який гідролізується до AITC. AITC ефективний у знищенні личинок комарів зі значенням LC50 19,35 ppm. Порівняно з AITC та BITC, ізотіоціанат 4-HBITC є найменш токсичним для личинок. Хоча AITC менш токсичний, ніж BITC, його значення LC50 нижчі, ніж у багатьох ефірних олій, протестованих на личинках комарів32,73,74,75.
Наш порошок насіння хрестоцвітих для боротьби з личинками комарів містить один основний глюкозинолат, що становить понад 98-99% від загальної кількості глюкозинолатів, визначеної за допомогою ВЕРХ. Були виявлені слідові кількості інших глюкозинолатів, але їхній рівень становив менше 0,3% від загальної кількості глюкозинолатів. Порошок насіння крес-салату (L. sativum) містить вторинні глюкозинолати (синігрин), але їхня частка становить 1% від загальної кількості глюкозинолатів, і їх вміст все ще незначний (близько 0,4 мг/г порошку насіння). Хоча PG та DFP містять один і той самий основний глюкозинолат (мірозин), ларвіцидна активність їх насіннєвого шроту значно відрізняється через значення LC50. Різниця в токсичності для борошнистої роси. Поява личинок Aedes aegypti може бути пов'язана з різницею в активності мірозинази або стабільності між двома видами насіння. Активність мірозинази відіграє важливу роль у біодоступності продуктів гідролізу, таких як ізотіоціанати, у рослин Brassicaceae76. Попередні дослідження Покока та ін.77 та Вілкінсона та ін.78 показали, що зміни активності та стабільності мірозинази також можуть бути пов'язані з генетичними та екологічними факторами.
Очікуваний вміст біоактивного ізотіоціанату було розраховано на основі значень LC50 кожного насіннєвого борошна через 24 та 72 години (Таблиця 5) для порівняння з відповідними хімічними застосуваннями. Через 24 години ізотіоціанати в насіннєвому борошні були більш токсичними, ніж чисті сполуки. Значення LC50, розраховані на основі частин на мільйон (ppm) обробки насіння ізотіоціанатом, були нижчими, ніж значення LC50 для застосувань BITC, AITC та 4-HBITC. Ми спостерігали, як личинки споживали гранули насіннєвого борошна (Рисунок 3A). Отже, личинки можуть отримувати більш концентрований вплив токсичних ізотіоціанатів, ковтаючи гранули насіннєвого борошна. Це було найбільш очевидно при обробці насіннєвим борошном IG та PG при 24-годинному впливі, де концентрації LC50 були на 75% та 72% нижчими, ніж при обробці чистим AITC та 4-HBITC відповідно. Обробки Ls та DFP були більш токсичними, ніж чистий ізотіоціанат, зі значеннями LC50 на 24% та 41% нижчими відповідно. Личинки в контрольній групі успішно залялькувалися (рис. 3B), тоді як більшість личинок у групі з насіннєвим борошном не залялькувалися, а розвиток личинок значно затримався (рис. 3B,D). У Spodopteralitura ізотіоціанати пов'язані із затримкою росту та розвитку79.
Личинки комарів Ae. Aedes aegypti безперервно піддавалися впливу порошку насіння Brassica протягом 24–72 годин. (A) Мертві личинки з частинками насіннєвого борошна в ротовому апараті (обведені колом); (B) Контрольна обробка (dH20 без додавання насіннєвого борошна) показує, що личинки ростуть нормально та починають заляльковуватися через 72 години (C, D) Личинки, оброблені насіннєвим борошном; насіннєве борошно показало відмінності в розвитку та не заляльковувалося.
Ми не вивчали механізм токсичної дії ізотіоціанатів на личинки комарів. Однак попередні дослідження на рудих вогняних мурахах (Solenopsis invicta) показали, що пригнічення глутатіон-S-трансферази (GST) та естерази (EST) є основним механізмом біоактивності ізотіоціанату, і AITC, навіть при низькій активності, також може пригнічувати активність GST. рудих вогняних мурах у низьких концентраціях. Доза становить 0,5 мкг/мл80. Навпаки, AITC пригнічує ацетилхолінестеразу у дорослих кукурудзяних довгоносиків (Sitophilus zeamais)81. Аналогічні дослідження необхідно провести для з'ясування механізму активності ізотіоціанату у личинок комарів.
Ми використовуємо обробку інактивованим нагріванням DFP для підтвердження припущення, що гідроліз рослинних глюкозинолатів з утворенням реакційноздатних ізотіоціанатів служить механізмом контролю личинок комарів за допомогою шроту з гірчичного насіння. Насіннєвий шрот DFP-HT не був токсичним при протестованих нормах внесення. Лафарга та ін.82 повідомили, що глюкозинолати чутливі до деградації за високих температур. Очікується також, що термічна обробка денатурує фермент мірозиназу в насіннєвому шроті та запобігає гідролізу глюкозинолатів з утворенням реакційноздатних ізотіоціанатів. Це також було підтверджено Окунаде та ін.75, які показали, що мірозиназа чутлива до температури, показуючи, що активність мірозинази повністю інактивується, коли насіння гірчиці, чорної гірчиці та кров'яного кореня піддається впливу температур вище 80°C. Ці механізми можуть призвести до втрати інсектицидної активності термічно обробленого насіннєвого шроту DFP.
Таким чином, шрот з насіння гірчиці та його три основні ізотіоціанати є токсичними для личинок комарів. Враховуючи ці відмінності між насіннєвим шротом та хімічною обробкою, використання насіннєвого шроту може бути ефективним методом боротьби з комарами. Існує потреба у визначенні відповідних рецептур та ефективних систем доставки для підвищення ефективності та стабільності використання порошків насіння. Наші результати вказують на потенційне використання шроту з насіння гірчиці як альтернативи синтетичним пестицидам. Ця технологія може стати інноваційним інструментом для боротьби з комарами-переносниками. Оскільки личинки комарів процвітають у водному середовищі, а глюкозинолати насіннєвого шроту ферментативно перетворюються на активні ізотіоціанати при гідратації, використання шроту з насіння гірчиці у воді, зараженій комарами, пропонує значний потенціал контролю. Хоча ларвіцидна активність ізотіоціанатів варіюється (BITC > AITC > 4-HBITC), необхідні додаткові дослідження, щоб визначити, чи поєднання насіннєвого шроту з кількома глюкозинолатами синергетично збільшує токсичність. Це перше дослідження, яке демонструє інсектицидну дію знежиреного насіннєвого шроту хрестоцвітих та трьох біоактивних ізотіоціанатів на комарів. Результати цього дослідження відкривають нові горизонти, показуючи, що знежирений шрот з насіння капусти, побічний продукт екстракції олії з насіння, може служити перспективним ларвіцидним засобом для боротьби з комарами. Ця інформація може допомогти у подальшому відкритті засобів біоконтролю рослин та їх розробці як дешевих, практичних та екологічно чистих біопестицидів.
Набори даних, згенеровані для цього дослідження, та результуючі аналізи доступні у відповідного автора за обґрунтованим запитом. Після завершення дослідження всі матеріали, використані в дослідженні (комахи та насіннєве борошно), були знищені.
Час публікації: 29 липня 2024 р.